动蛋白Kinesin-13A和类锚蛋白AtANK1在植物细胞中的分布及功能

论文题目: 动蛋白Kinesin-13A和类锚蛋白AtANK1在植物细胞中的分布及功能

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物学

作者: 魏丽勤

导师: 李岩

关键词: 动蛋白,锚蛋白,高尔基体,内质网,根冠,花粉管,拟南芥,烟草

文献来源: 中国农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 高尔基体是细胞分泌途径中一个非常重要的细胞器。通常认为植物细胞中高尔基体的定位、组装与功能主要由微丝-肌球蛋白系统来维持,而微管及其马达蛋白对于植物细胞高尔基体的结构和功能是否起作用还存在争议。 Kinesin-13A是一个中央马达动蛋白;其在拟南芥的多种细胞中与高尔基体共定位,表明它可能是一类参与植物细胞高尔基体结构与功能调控的动蛋白（Lu et al,2005）;然而,目前为止,尚缺乏该动蛋白在植物细胞高尔基体上精确定位的研究,也不清楚其在植物细胞高尔基体结构与功能方面的具体作用。我们通过免疫金标结合电子显微镜观察,发现AtKinesin-13A定位于拟南芥根冠细胞高尔基体附近的囊泡膜上。利用相应基因的T-DNA插入突变体,我们发现AtKinesin-13A缺失突变后,拟南芥根冠分泌活动较旺盛细胞中高尔基体附近的囊泡数目明显减少,而且其直径也变小,细胞出现液泡化;同时,根冠外周的边缘细胞数目也明显减少。通过干旱处理,发现突变体更早的萎蔫死亡,说明AtKinesin-13A缺失突变体较野生型对干旱更加敏感。根据以上结果,我们认为AtKinesin-13A可能参与了高尔基体囊泡形成和维持的调控;至于其功能缺失后细胞的液泡化和植株对干旱的更加敏感可能是间接作用的结果。通过简并RT-PCR和用AtKinesin-13A的抗体免疫印迹发现烟草中也存在AtKinesin-13A类似蛋白即NtKinesin-13A,其分子量约为120kDa,且其表达无组织特异性,结合AtKinesin-13类似基因在棉花、水稻等植物的存在,可以推测Kinesin-13A在植物细胞中普遍存在。免疫荧光和免疫金标发现NtKinesin-13A也定位于高尔基体附近的囊泡膜上。AtKinesin-13A与NtKinesin-13A在细胞中定位的相同,预示两者在相应植物中可能有相同的生物学功能。锚蛋白最初是作为动物细胞膜骨架的成分被发现的,其最显著的结构特点是具有数目不等的串联重复的锚蛋白重复序列ANKrepeat。随后,在几乎所有的动物细胞膜下都发现以锚蛋白和红膜肽为主要成分的膜骨架系统。而高尔基体膜骨架的发现更是引起了广泛关注。然而,在植物细胞中,尤其是高尔基体的膜上是否也存在如同动物细胞一样的骨架系统还存在争议。到目前为止,在植物细胞中还没有发现与膜骨架有关的锚蛋白类似蛋白。此外,拟南芥基因组中有105个基因,其编码的蛋白含有ANKrepeat,但其中大多数基因的功能尚不清楚。我们通过RT-PCR从拟南芥中克隆到一个类锚蛋白基因AtANK1,通过免疫印迹发现其编码的蛋白分子量约为70kDa。AtANK1是拟南芥中与人类细胞高尔基体上119kDa锚蛋白AnkG119最为类似的ANKrepeat包含蛋白。AnkG119与内质网及高尔基体特异的βⅢspcctrin和COP Ⅰ共定位,预示着AnkG119可能在内膜系统的组装方面起某种作用。通过免疫荧光标记和免疫电镜技术发现,AtANK1定位于拟南芥多种类型细胞的内质网膜上。尽管AtANK1的分子量远远小于哺乳类细胞中的锚蛋白,但其与AnkG119类似的细胞定位及序列上的相似性,表明两者可能具有类似的功能。我们推测,AtANK1可能在植物细胞内质网功能域的组装或内质网与高尔基体间的物质交流方面起重要作用。

论文目录:

摘要

ABSTRACT

缩写表

第一章文献综述

一、动蛋白的研究进展

1 动蛋白的分子特点

2 与高尔基体有关的动蛋白

3 植物细胞中的动蛋白研究

4 本课题的研究意义及目的

二、锚蛋白的研究

1 锚蛋白的分子特点及异形体

2 动物细胞高尔基体膜骨架相关的锚蛋白异形体

3 锚蛋白相互作用蛋白

4 锚蛋白的功能

5 ANK repeat

6 植物细胞锚蛋白的研究

7 拟南芥中AtAnkTM基因家族

8 本课题研究意义

第二章材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

1 总RNA的提取

2 烟草Kinesin-13A类蛋白基因NtKinesin-13A的RT-PCR克隆及原核表达

3 拟南芥类锚蛋白基因AtANK1 cDNA全长的克隆及原核表达载体pGEX-AtANK1-N的构建、原核表达及表达产物的纯化

4 拟南芥类锚蛋白基因AtANK1原核表达载体pET-AtANK1-N的构建、原核表达及表达产物的纯化

5 拟南芥类锚蛋白AtANK1抗血清的制备及抗体的纯化与鉴定

6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹

7 烟草花粉的萌发

8 拟南芥根尖压片的制备

9 免疫荧光定位及共聚焦激光扫描显微镜观察

10 免疫金标及电子显微镜观察

11 常规电子显微镜观察及统计分析

12 拟南芥根尖的微分干涉衬显微镜观察及统计分析

13 干旱处理后拟南芥根长的统计学分析

14 图像后期处理及打印

第三章实验结果

一、拟南芥动蛋白AtKinesin-13A的功能研究

1 AtKinesin-13A在拟南芥中的细胞定位

2 AtKinesin-13A在拟南芥根尖细胞高尔基体上的精确定位

3 AtKinesin-13AT-DNA插入突变体的筛选和确定

4 AtKinesin-13A-1突变体较野生型对干旱敏感

5 AtKinesin-13A缺失突变后拟南芥根冠边缘细胞数目减少

6 AtKinesin-13A功能缺失突变后对根冠细胞高尔基体的影响

二、烟草花粉管中与高尔基体及其囊泡相结合的动蛋白相关蛋白的基因克隆与蛋白分布研究

1 烟草NtKinesin-13A基因片段的克隆和鉴定

2 烟草NtKinesin-13A分子量的确定

3 烟草NtKinesin-13A的组织表达情况

4 烟草花粉管中NtKinesin-13A的免疫荧光标记和共聚焦激光扫描显微镜观察

5 烟草花粉管中NtKinesin-13A的亚细胞定位

三、类锚蛋白AtANK1在植物细胞中的存在与分布

1 拟南芥中类锚蛋白AtANK1基因的克隆

2 二级结构预测

3 AtANK1在原核细胞中的表达与表达产物的纯化

4 AtANK1抗体的制备及鉴定

5 拟南芥中AtANK1分子量的确定

6 AtANKI在拟南芥不同组织中的表达情况

7 AtANK1在拟南芥不同组织细胞中的免疫荧光标记和共聚焦激光扫描显微镜观察

8 AtANK1的亚细胞定位

第四章讨论

一、动蛋白AtKinesin-13A在植物细胞中的存在与作用

1 Kineisn-13A调控拟南芥根冠分泌细胞高尔基体结构和功能

2 AtKineisn-13A突变后拟南芥植株对干旱更加敏感

3 Kineisn-13A是植物细胞高尔基体特异的中央马达动蛋白

4 Kinesin-13A在植物细胞中普遍存在

二、类锚蛋白AtANK1在植物细胞中的存在与作用

1 拟南芥细胞中存在类锚蛋白AtANK1

2 AtANK1属于拟南芥中AtANKTM家族成员

3 AtANK1分布于内质网上及其可能的作用

4 植物细胞中其它可能的类锚蛋白

第五章结论

参考文献

致谢

作者简介

发布时间: 2005-07-18

参考文献

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