大豆RuBP羧化酶小亚基基因（rbcS）启动子的克隆及功能鉴定

论文摘要

1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶（Rubisco）存在于所有高等植物中,是光合作用中的关键酶,也是光合植物叶片中含量最丰富的蛋白质（约占可溶性总蛋白的50%）。Rubisco由8个大亚基（rbcL）和8个小亚基（rbcS）组成,其中rbcS基因的表达受光调控,并具有叶组织特异性,rbcS启动子经证实是一种高效表达的调控元件。本文对大豆rbcS基因SRS4启动子进行了初步探索,研究表明大豆rbcS基因SRS4启动子可为基因工程技术提供目标表达启动子,对转基因作物的培育具有重要的应用价值。本文克隆了大豆rbcS基因SRS4启动子并通过农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草研究了该启动子的功能,主要结果如下：1.采用TAIL-PCR技术获得867bp的大豆rbcS基因SRS4启动子5’侧翼序列,随后利用常规PCR技术克隆得到1540bp的大豆rbcS基因SRS4启动子序列并对其进行分析,发现该序列除具有启动子基本元件外,还含有许多与光诱导有关的顺式作用元件（Ⅰ盒、GATA盒、GT-1结合位点等）及其它胁迫诱导元件。2.以双元载体pCAMBIA1301为基础,成功构建了含有大豆rbcS基因SRS4启动子,以gus基因为报告基因的植物表达载体,命名为pCAMBIA-GrbcSP;通过三亲杂交法将pCAMBIA-GrbcSP和pCAMBIA1301质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,获得农杆菌重组菌株。3.研究农杆菌转化烟草的5个影响因子来优化烟草遗传转化体系。采用优化好的遗传体系,将pCAMBIA-GrbcSP和pCAMBIA1301质粒导入烟草中,获得了43株具有Kan抗性的烟草,经鉴定其中有41株呈阳性。4.抗性烟草经PCR检测和GUS染色分析,初步表明外源目的片段已整合到烟草基因组DNA中并能驱动gus基因的表达。GUS荧光定量分析进一步显示,大豆rbcS基因SRS4启动子可使gus基因在转基因烟草中的表达具有一定的叶组织特异性,且表达量与35S启动子基本一致。5.将pCAMBIA-GrbcSP阳性植株暗处理7d后置于光照下继续培养,嫩叶和成熟叶中gus基因表达量的变化存在差异,但从嫩叶中gus基因表达量的变化来看,本试验克隆的大豆rbcS基因SRS4启动子具有一定的光诱导性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 我国大豆产业的概况
• 1.2 植物启动子的研究进展
• 1.3 RBCS基因的研究概况
• 1.4 本实验的研究目的和意义
• 1.5 本实验的技术路线
• 第二章 大豆RBCS启动子的克隆和植物表达载体的构建
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 结果与分析
• 1.3.1 大豆基因组DNA的提取
• 1.3.2 TAIL-PCR结果
• 1.3.3 大豆rbcS启动子的克隆及序列分析
• 1.3.4 大豆rbcS启动子植物表达载体的鉴定
• 1.4 讨论
• 1.5 小结
• 第三章 大豆RBCS启动子的功能鉴定
• 第一节 农杆菌介导的烟草遗传转化
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 结果与分析
• 1.3.1 烟草无菌苗的培养
• 1.3.2 无菌苗苗龄对外植体再生能力的影响
• 1.3.3 卡那霉素筛选压的确定
• 1.3.4 抑菌抗生素Cef浓度的确定
• 1.3.5 农杆菌菌液浸染时间对遗传转化率的影响
• 1.3.6 共培养时间对烟草转化的影响
• 1.3.7 抗性烟草的获得
• 1.4 讨论
• 1.5 小结
• 第二节 转基因烟草的检测
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 结果与分析
• 1.3.1 gus基因的PCR检测
• 1.3.2 转基因植株的GUS组织化学分析
• 1.3.3 转基因植株的GUS活性检测
• 1.3.4 转基因植株经光诱导后gus基因的表达
• 0代转基因植株的移栽'>1.3.5 T₀代转基因植株的移栽
• 1.4 讨论
• 1.5 小结
• 1.6 有关下步的实验计划
• 第四章 结论及展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介