用单克隆抗体研究对虾白斑症病毒（WSSV）的黏附蛋白

论文摘要

白斑症病毒（WSSV）引起的对虾白斑病自1993年暴发以来,给对虾养殖造成了严重的损失。有关对虾白斑症病毒病,已积累了丰富的的研究资料。由于WSSV囊膜上的黏附蛋白与宿主细胞受体的结合在WSSV吸附和侵入过程中起关键作用,因此研究黏附蛋白与细胞受体以及两者之间的相互作用是探讨WSSV感染的分子基础。本论文进行了中国对虾血细胞的原代培养,用WSSV感染培养的细胞,检测了病毒对培养细胞的感染以及在细胞内的增殖。并用酶联免疫吸附法（ELISA）、免疫印迹法（DOT-BLOT）、原代培养的对虾血细胞以及螯虾动物模型检测筛选WSSV的中和单抗。同时,提纯WSSV囊膜蛋白,研制了囊膜蛋白VP19的单抗,检测了其中和性。具体的研究内容和结果如下。从中国对虾心脏中抽取血细胞,用7种培养基培养,以2×L-15为基本培养基,加入20%新生牛血清,20%GIT培养基,2%的葡萄糖,调节pH到7.2-7.4,25℃培养,倒置相差显微镜观察发现对虾血细胞可活20天左右。用不同浓度的白斑症病毒病毒液感染原代培养的对虾血细胞,倒置相差显微镜观察感染细胞的死亡状况,发现被感染细胞的病变情况不同。用10-1-10-6浓度白斑症病毒梯度稀释液感染原代培养的中国对虾血细胞,利用相差显微镜连续5d定时观察了血细胞的死亡情况;用10-3浓度病毒液感染培养的血细胞不同时间和10-1-10-8浓度病毒液感染培养的血细胞10d,通过WSSV的混合单抗和过氧化物酶（HRP）联二抗进行免疫吸附测定检测被感染血细胞内的病毒。结果显示,10-1-10-2浓度病毒液感染的血细胞明显缩小,有死亡现象,可见细胞碎片,细胞数目逐渐减少,细胞碎片聚集成堆;10-3-10-4浓度的病毒液感染的血细胞明显缩小,细胞聚集成堆,但无明显死亡,较10-2浓度病毒液感染的血细胞出现细胞病变时间明显延长;10-5-10-6浓度病毒液感染的血细胞在5d内无明显的细胞病变。血细胞在接种10-3浓度病毒液后,细胞内病毒在第7d达到最大值。10-1-10-8浓度的病毒液感染血细胞10d后,被感染细胞内的病毒有增殖。用细胞免疫化学方法证实WSSV可以感染原代培养的对虾血细胞,表明

论文目录

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• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 对虾白斑症病毒（WSSV）的研究进展
• 1.2 对虾病毒中和抗体的研究进展
• 2 WSSV 在原代培养的中国对虾血细胞内的感染增殖
• 2.1 中国对虾血细胞的原代培养
• 2.2 WSSV 感染原代培养虾血细胞
• 2.3 细胞免疫化学法检测WSSV
• 2.4 WSSV 体外增殖
• 3 白斑症病毒与中国对虾血细胞膜的结合
• 3.1 白斑症病毒的提纯
• 3.2 中国对虾血细胞膜的粗提
• 3.3 白斑症病毒与中国对虾血细胞膜的结合
• 3.4 讨论
• 4 抗白斑症病毒中和单克隆抗体的筛选
• 4.1 DOT BLOT 筛选白斑症病毒的中和抗体
• 4.2 ELISA 筛选白斑症病毒的中和抗体
• 4.3 原代细胞培养筛选白斑症病毒的中和抗体
• 4.4 螯虾体内中和实验筛选WSSV 的中和抗体
• 4.5 讨论
• 5 WSSV 囊膜蛋白的单克隆抗体的研制及其中和效果分析
• 5.1 病毒囊膜蛋白的提纯
• 5.2 病毒囊膜蛋白单抗的制备
• 5.3 ELISA 检测囊膜蛋白VP19 单抗的中和效果
• 5.4 螯虾动物模型检测囊膜蛋白VP19 单抗的中和效果
• 5.5 讨论
• 参考文献
• 致谢