抗老年痴呆天然活性成分的初步筛选

论文摘要

本文将老年痴呆的两种可能的致病机制：胆碱能损伤学说和自由基损伤学说相结合,主要建立了两种高通量筛选方法：乙酰胆碱酯酶抑制活性高通量筛选模型以及DPPH自由基清除微量筛选模型。旨在筛选出乙酰胆碱酯酶抑制活性以及DPPH自由基清除活性均较为显著的活性成分,从而达到协同治疗阿尔兹海默病(AD)的目的。首先建立了乙酰胆碱酯酶抑制活性高通量筛选模型,对66种不同的天然成分进行筛选,筛选出藤茶及其主要单体成分二氢杨梅素、远志总皂苷及其水解产物远志次苷四种活性十分显著的成分,其IC50值分别为451.11±21.09μg/mL、495.46±47.05μg/mL、31.82±2.05μg/mL、286.12±1.17μg/mL。同时,二氢杨梅素的结构类似物杨梅素和杨梅苷在0.25mg/mL的浓度下也具有乙酰胆碱酯酶活性,抑制率分别为30.664±4.05%、38.48±±1.98%。其次建立了DPPH自由基清除能力微量模型,对杨梅素、二氢杨梅素和杨梅苷以及它们的主要存在部位的抗氧化活性同步分析,并用薄层法做进一步验证,旨在筛选出抗氧化活性较为显著的成分,结果表明二氢杨梅素的DPPH自由基清除活性极为显著,其IC50值为10.7μg/mL,强于阳性药VC(14.69μg/mL)和芦丁(31.32μg/mL)。然而,杨梅素、杨梅苷、二氢杨梅素的乙酰胆碱酯酶抑制活性并不稳定,其中二氢杨梅素的稳定性相对较好。因三者结构上都含有较多的酚羟基,推测可能与化合物本身的稳定性有关,因此对杨梅苷的稳定性做进一步的补充研究,结果表明杨梅苷溶液应在中性或弱酸性条件下低温或常温保存,并避免接触重金属离子。鉴于以上的研究成果,二氢杨梅素具有、十分显著的乙酰胆碱酯酶抑制活性和DPPH自由基清除活性,极具进一步开发成为抗老年痴呆新药主要活性成分的潜力。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 1 前言
• 1.1 老年痴呆症概述
• 1.2 AD的病理学特征及其致病机制
• 1.2.1 AD的病理学特征
• 1.2.2 AD致病机制假说
• 1.3 基于不同的致病机制提出不同的治疗方案
• 1.3.1 改善胆碱能系统功能药
• 1.3.2 减少氧化应激和神经细胞内钙超载的药物
• 1.3.3 干扰Aβ形成和沉积药物
• 1.3.4 神经营养因子
• 1.3.5 具有潜在抗老年痴呆作用的天然成分
• 1.3.6 中药复方治疗AD近况
• 1.3.7 临床使用老年痴呆药物及服用方法汇总
• 1.4 乙酰胆碱酯酶抑制剂临床治疗现状及活性评价
• 1.4.1 乙酰胆碱酯酶抑制剂临床治疗毒副反应
• 1.4.2 乙酰胆碱酯酶抑制药活性评价
• 1.5 乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选方法及应用
• 1.5.1 紫外分光光度法
• 1.5.2 荧光法
• 1.5.3 微分析技术
• 1.5.4 其它分离分析方法
• 1.6 抗氧化能力的测定方法及研究进展
• 1.6.1 抗氧化剂与自由基
• 1.6.2 天然抗氧化剂的体外筛选方法
• 1.6.3 DPPH自由基清除能力的测定
• 1.7 藤茶、杨梅、远志概述
• 1.7.1 藤茶及主要活性成分杨梅素、二氢杨梅素
• 1.7.2 杨梅及主要活性成分杨梅苷
• 1.7.3 远志及远志总苷、远志次苷
• 1.8 研究目的及意义
• 1.9 研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 原料及试剂
• 2.1.2 仪器与设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 乙酰胆碱酯酶抑制高通量筛选模型的建立
• 2.2.2 微孔板法测定DPPH自由基清除能力
• 2.2.3 部分筛选样品的制备
• 2.2.4 薄层法测定DPPH自由基清除能力
• 2.2.5 杨梅素、二氢杨梅素、杨梅苷乙酰胆碱酯酶抑制活性稳定性
• 2.2.6 杨梅苷稳定性的研究
• 3 结果与讨论
• 3.1 乙酰胆碱酯酶抑制活性筛选体系的方法学考察
• 3.1.1 酶液的稀释倍数对反应的影响
• 3.1.2 DTNB浓度对反应的影响
• 3.1.3 底物浓度对酶活的影响
• 3.1.4 反应温度对酶活的影响
• 3.1.5 pH对酶活的影响
• 3.1.6 孵育时间对酶活的影响
• 3.1.7 反应时间对体系的影响
• 3.2 阳性药验证乙酰胆碱酯酶筛选模型的合理性
• 3.2.1 他克林
• 3.2.2 加兰他敏
• 3.2.3 多奈哌齐
• 3.3 乙酰胆碱酯酶抑制活性高通量筛选结果
• 3.3.1 30种混合物
• 3.3.2 7种挥发油
• 3.3.3 5种皂苷类
• 3.3.4 24种单体
• 3.4 藤茶、二氢杨梅素、远志总苷、远志次苷乙酰胆碱酯酶抑制活性评价结果
• 3.5 杨梅素、杨梅苷、二氢杨梅素乙酰胆碱酯酶抑制活性稳定性研究
• 3.6 DPPH自由基清除微量模型的建立
• 3.6.1 trolox加入量对反应的影响
• 3.6.2 DPPH溶液加入量对反应的影响
• 3.6.3 DPPH溶液浓度对反应的影响
• 3.6.4 trolox标准曲线的绘制
• 3.6.5 DPPH自由基清除微量模型的筛选结果
• 3.7 薄层法筛选DPPH自由基清除能力结果
• 3.8 杨梅苷单体分离及结构鉴定
• 3.8.1 杨梅苷分离工艺流程
• 3.8.2 薄层法测定杨梅苷纯度
• 1H-NMR,¹³C-NMR光谱分析鉴定结构结果'>3.8.3¹H-NMR,¹³C-NMR光谱分析鉴定结构结果
• 3.9 杨梅苷稳定性研究
• 3.9.1 杨梅苷液相色谱图
• 3.9.2 线性关系考察
• 3.9.3 精密度试验
• 3.9.4 稳定性试验
• 3.9.5 pH值对杨梅苷溶液稳定性的影响
• 3.9.6 温度对杨梅苷溶液稳定性的影响
• 3.9.7 金属离子对杨梅苷溶液稳定性的影响
• 4 结论
• 4.1 乙酰胆碱酯酶抑制活性模型的建立及高通量筛选
• 4.1.1 乙酰胆碱酯酶抑制活性筛选最佳反应体系
• 4.1.2 阳性药验证乙酰胆碱酯酶抑制活性筛选模型
• 4.1.3 乙酰胆碱酯酶抑制活性高通量筛选结果
• 4.1.4 藤茶、二氢杨梅素、远志总皂苷及次苷的乙酰胆碱酯酶抑制活性评价
• 4.1.5 杨梅素、杨梅苷、二氢杨梅素乙酰胆碱酯酶抑制活性稳定性
• 4.2 DPPH自由基清除微量模型的建立及筛选结果
• 4.2.1 DPPH自由基清除活性筛选最佳反应条件
• 4.2.2 trolox标准曲线的绘制
• 4.2.3 DPPH自由基清除模型筛选结果
• 4.3 薄层板筛选DPPH自由基清除能力结果
• 4.4 分离得到杨梅苷体的纯度鉴定
• 4.5 杨梅苷的稳定性研究
• 4.5.1 杨梅苷的HPLC法检测以及标准曲线的绘制
• 4.5.2 精密度与稳定性考察
• 4.5.3 pH值对杨梅苷溶液稳定性的影响
• 4.5.4 温度对杨梅苷溶液稳定性的影响
• 4.5.5 金属离子对杨梅苷溶液稳定性的影响
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 8 致谢
• 附图