论文摘要
背景：以肝切除为代表的外科治疗仍是原发性肝癌的首选治疗方法。但由于原发性肝癌的早期发现存在困难，肝癌切除术后的5年复发率高达60％以上，切除术后的综合治疗在原发性肝癌的治疗中仍然占有重要的地位。化疗是综合治疗的主要手段之一，而各种针对原发性肝癌的临床化疗总体有效率仅为18.2％～47％，并且进展缓慢。提供切实可行的个体化化疗方案成为临床工作者面对原发性肝癌治疗上的迫切需要。随着近年来肿瘤干细胞（TSC）理论的确立，对于实体肿瘤的治疗有了新的认识：TSC是肿瘤发生、浸润、转移和复发等恶性生物学行为的核心，是肿瘤细胞成瘤能力的决定因素。只要存在肿瘤干细胞，肿瘤就难以治愈。本实验室的前期研究中在大鼠原发性肝癌已经初步鉴定了具备TSC特征（极强的致瘤能力和自我更新并多向分化）的肿瘤细胞亚群。由此如果能够建立一种针对原发性肝癌肿瘤干细胞的个体化化疗方案，靶向杀伤肿瘤干细胞，将有希望在原发性肝癌的化疗进展上取得突破。目前对于包括肝癌在内的绝大多数实体瘤来说，缺乏鉴定TSC的统一标准，而分离出纯度高的TSC，直接进行药敏实验的技术难度、成本都比较大。较多研究表明，肝干细胞是肝细胞癌和胆管癌的祖细胞。来源于骨髓干细胞的肝卵圆细胞（Hepatic oval cell，HOC）具备肝脏干细胞性质，是肝癌干细胞的对应成体干细胞。卵圆细胞不仅具有同骨髓干细胞相似的表面标志，如CD34、Thy-1（CD90）、c-kit（CD117），并且在耐药机制上也类似干细胞。骨髓干细胞分为造血干细胞和间充质干细胞，相比较TSC而言易于分离鉴定，药敏实验的可行性较高。基于上述理由，本课题利用肿瘤干细胞与骨髓干细胞的关系，重点研究骨髓干细胞在针对肝癌干细胞个体化化疗的药物敏感实验中的应用。目的：研究大鼠骨髓造血干细胞与大鼠原发性肝癌细胞药敏与肝癌细胞成瘤能力的相关性；探讨利用造血干细胞，进行针对肝癌干细胞药物敏感实验的可能性。并研究了药物对骨髓间充质干细胞、肝癌细胞和HepG2细胞的药敏差异。方法：30只雄性清洁级SD大鼠应用0.025％二乙基亚硝胺水溶液饲喂24周建立大鼠原发性肝癌模型，选取诱癌成功大鼠8只，用组织块法分离培养原代肝癌细胞；用免疫磁珠法分离骨髓造血干细胞，流式细胞仪检测传代细胞表面标志CD34。筛选五种不同作用机制抗肿瘤药物表阿霉素、5-氟尿嘧啶（5-FU）、健择、环磷酰胺、顺铂作用24小时后，SRB法分别检测化疗药物对造血干细胞与肝癌细胞的抑制率。同时药物作用后的肝癌细胞接种至裸鼠，6周后测量移植瘤重量观察其成瘤实验的差异，对模型大鼠造血干细胞、肿瘤细胞抑制率与化疗药物作用后肿瘤细胞移植裸鼠后的成瘤重量分别进行相关性分析。另取原代培养肿瘤细胞与间充质干细胞，同时与HepG2细胞系细胞，SRB法进行药物敏感实验，观察药物敏感性的差异。结果：（1）表阿霉素、5-氟尿嘧啶、健择、环磷酰胺、顺铂五种药物对肝癌大鼠造血干细胞抑制率分别为26.44±3.14、29.72±5.05、25.98±3.34、26.91±2.70、27.21±3.93；对肝癌细胞抑制率分别为：44.43±5.80、56.53±6.50、41.93±7.31、45.53±4.65、54.07±5.02。表阿霉素、5-氟尿嘧啶、健择、环磷酰胺、顺铂五种药物对肝癌大鼠造血干细胞抑制率与对肝癌细胞抑制率比较有显著性差异，t值与P值分别为：t=7.051（P=0.000）；t=9.513（P=0.000）；t=7.239（P=0.000）；t=12.023（P=0.000）与t=10.091（P=0.000）。（2）表阿霉素、5-氟尿嘧啶、健择、环磷酰胺、顺铂五种药物对肝癌细胞抑制率与其作用肝癌细胞后移植瘤重量间进行相关分析，具体相关系数为：表阿霉素r=0.065（P=0.878）；5-氟尿嘧啶，r=0.033（P=0.939）；健择r=-0.539（P=0.168）；环磷酰胺r=0.026（P=0.950）；顺铂r=0.600（P=0.116），均无相关性。而化疗药物对肝癌大鼠造血干细胞抑制率与对应药物作用后肝癌细胞移植瘤重量进行相关分析，具体相关系数为：表阿霉素r=-0.727（P=0.041）；5-氟尿嘧啶，r=-0.927（P=0.001）；健择r=-0.901（P=0.002）；环磷酰胺r=-0.774（P=0.024）；顺铂r=-0.783（P=0.022），化疗药物对造血干细胞抑制率与肝癌细胞增殖侵袭能力有负相关性，并且相关有统计学意义。对阿霉素、顺铂、洛拉曲克的敏感度从高到低依次为HepG2细胞，肝癌细胞，间充质细胞。而丝裂霉素药敏显示，3种细胞药物敏感度从高到低依次为HepG2，间充质干细胞，肝癌细胞。结论：（1）选取的五种临床常用化疗药物中，其作用机制互不相同。实验结果，同一个体的肝癌细胞和造血干细胞对不同的药物敏感性有差异。化疗药物对肝癌大鼠造血干细胞抑制率小于对肝癌细胞抑制率，肿瘤干细胞可能类似造血干细胞的耐药机制。（2）化疗药物对肝癌细胞抑制率不能完全反映肝癌细胞增殖侵袭能力。化疗药物对造血干细胞抑制率相对于肝癌细胞可以较好反映肿瘤细胞增殖侵袭能力。（3）肿瘤细胞药物敏感性与细胞系细胞和间充质细胞存在一定异同。