论文摘要
研究目的：该课题在本实验室前期研究基础上,进一步探讨RhoA-ROCK介导的人膜突蛋白（moesin）磷酸化对晚期糖基化终产物（AGEs）引起的内皮细胞形态和功能改变的调节作用。在前期研究中已经证明了：1.AGEs通过诱导moesin磷酸化,导致内皮细胞形态和功能的改变,进而引起血管通透性增高。2.Rho激酶（Rho kinase, ROCK）参与了AGEs引起的内皮细胞形态和功能的改变。因此本课题欲进一步解决以下问题：1.验证Rho/ROCK信号通路是否通过介导moesin的磷酸化,参与AGEs引起的内皮细胞形态和功能的调节。2.进一步探讨Rho/ROCK信号通路引起Inoesin磷酸化的方式,是否通过直接与moesin作用导致其磷酸化。3.进一步查明AGE/ROCK介导下moesin第558位苏氨酸残基（moesinT558）磷酸化在内皮细胞形态和功能改变中的作用,为改善该病理过程提供切入点。本课题选用RhoA显性负效突变体（RhoAN19）和组成型活性突变体（RhoA L63）的重组腺病毒感染细胞,应用G-LISA试剂盒检测法检测RhoA活性和免疫印迹技术检测ROCK的磷酸化,并结合本实验室前期研究使用ROCK抑制剂处理细胞所得结果,进一步明确Rho/ROCK通路是否参与了AGEs介导的内皮细胞形态及功能的改变；通过免疫共沉淀技术检测ROCK与moesin的相互作用,查明ROCK是否通过直接与moesin结合导致其磷酸化。通过分子克隆及体外定点突变技术分别构建moesin的真核表达质粒pcDNA3/HA-moesin及其抑制型突变体pcDNA3/HA-moesinT558A和激活型突变体pcDNA3/HA-moesinT558D,经脂质体转染脐静脉内皮细胞,经实时荧光定量PCR、免疫印迹、单层内皮细胞通透性的测定及内皮细胞骨架纤维状肌动蛋白（filamentous actin, F-actin）形态和定位的检测,并结合本实验室前期研究结果,进一步查明在AGEs诱导下moesin的具体磷酸化位点。本研究通过进一步明确RhoA/ROCK通路在AGEs导致的内皮细胞功能变化中的作用,查明ROCK介导moesin磷酸化的方式和moesinT558位点的功能,探讨AGEs引起的内皮细胞功能变化的分子机制,有助于阐明糖尿病性微血管病变发生发展的机制,并为其治疗提供新的思路。方法：AGE-HSA由人血清白蛋白与D-葡萄糖共孵育8周并过滤透析制得。体外培养人皮肤微血管内皮细胞及人脐静脉内皮细胞株,分别接种于微孔小皿（petri dish）、双层通透的培养皿（transwell）顶层小室微孔膜上（直径6.5mm,孔径大小0.4μm）、6 cm和10cm细胞培养皿上,待细胞长至融合或接近融合时,换无血清培养基继续培养24 h,使细胞获得同步生长,然后按实验分组分别处理备用。选用RhoA显性负效突变体（RhoAN19）和组成型活性突变体（RhoAL63）的重组腺病毒感染细胞,应用G-LISA试剂盒检测法检测RhoA活性和免疫印迹技术检测ROCK的磷酸化；经免疫共沉淀技术检测ROCK与]moesin的相互作用；经分子克隆及体外定点突变技术分别构建moesin磷酸化位点突变的真核表达质粒,抑制型突变体pcDNA3/HA-moesinT558A和激活型突变体pcDNA3/HA-moesinT558D分别以丙氨酸和天冬氨酸替代苏氨酸获得,经脂质体预转染内皮细胞24 h,继以AGE-HSA 50 mg/L孵育。用免疫荧光染色法、激光共聚焦显微镜观察细胞骨架肌动蛋白F-actin形态及分布改变；用免疫印迹技术检测]moesin的磷酸化,采用多功能蛋白组学影像系统KODAK2000R直接成像,以Image J钦件分析各组灰度值,P-actin为内参进行校正,以对照组面积灰度值为100%与实验组进行比较；用TRITC荧光标记蛋白漏出法测定单层内皮细胞的通透系数Pa值,实验结果以Pa变化百分比表示,Pa%=（实验样品Pa值/对照样品Pa值）×100。结果：1.AGE-HSA诱导内皮细胞RhoA活性增高（1） AGE-HSA以时间和剂量依赖的方式引起内皮细胞RhoA活性增高给予AGE-HSA刺激引起RhoA活性显著增加,且呈时间（F=14.169,P=0.000）和剂量（F=8.405,P=0.000）依赖性。在时间效应组中,随着AGE-HSA作用时间的延长,细胞中RhoA活性逐渐增高,与对照组相比,从30min分钟起差异有统计学意义（P=0.002）,至60min时,到达峰值,随后RhoA活性开始缓慢下降,当AGE-HSA作用120min时与对照组相比差异仍有统计学意义（P=0.000）。剂量效应组中,随着AGE-HSA浓度的增加,内皮细胞细胞中RhoA活性逐渐增多,当AGE-HSA浓度达到25mg/L时,与对照组相比,差异具有统计学意义（P=0.008）,随着AGE-HSA浓度增加,RhoA活性持续增加,当达到50 mg/L时,RhoA活性达到峰值（P=0.000）,当达到100mg/L时,RhoA活性开始下降,但与对照相比,仍有显著的统计学意义（P=0.001）。结果提示：AGE-HSA能引起内皮细胞RhoA活性的增高,并呈时间和剂量依赖性。（2）L63和N19重组腺病毒对AGE-HSA介导的RhoA活性变化的影响与对照组相比,给予AGE-HSA刺激后,RhoA活性明显增高（P=0.000）,转染组成型活性突变体（RhoAL63）后,RhoA活性也明显增高（P=0.000）,转染RhoA显性负效突变体（RhoA N19）后可下调RhoA的活性（P=0.000）,而先转染显性负效突变体（RhoAN19） 24 h后,然后再和AGE-HSA作用,则明显抑制了AGE-HSA引起的RhoA活性增高（P=0.000）。（3）L63和N19重组腺病毒对AGE-HSA介导的ROCK磷酸化的影响与对照组相比,给予AGE-HSA刺激ROCK磷酸化水平明显增高（P=0.001）,转染组成型活性突变体（RhoAL63）后ROCK磷酸化水平也明显增高（P=0.001）,而先转染RhoA显性负效突变体24h后,再给予AGE-HSA 50 mg/L刺激1h后,ROCK磷酸化水平较AGE-HSA组下降（P=0.019）。结果提示：AGE-HSA通过激活RhoA导致ROCK磷酸化,下调RhoA活性可以抑制AGE-HSA诱导的ROCK磷酸化。（4）L63和N19重组腺病毒对AGE-HSA介导的,moesin磷酸化的影响给予AGE-HSA刺激及转染组成型活性突变体（RhoAL63）后,moesin磷酸化水平明显增高（P=0.000）,先转染RhoA显性负效突变体（RhoA N19） 24 h后,再给予AGE-HSA 50 mg/L刺激1h后,moesin磷酸化水平较AGE组下降（P=0.001）,提示下调RhoA活性可以抑制AGE诱导的moesin磷酸化。结果提示：下调RhoA活性可以抑制AGE-HSA诱导的moesin磷酸化。2.内皮细胞内源性ROCK与moesin的相互作用提取内皮细胞总蛋白后,以moesin特异性抗体免疫沉淀后,再以ROCK特异性抗体做免疫印迹检测,结果在有或无AGE-HSA刺激的条件下,均可检测到ROCK,分子量大小与阳性对照组相同,而阴性对照组未检测到。再以ROCK特异性抗体免疫沉淀后,以moesin特异性抗体做免疫印迹检测,结果同样在有或无AGE-HSA刺激的条件下,均可检测到moesin。提示在正常情况下细胞内源性ROCK与moesin存在于一个复合体中,因此本研究进一步检测了p-ROCK与moesin的相互作用,以p-ROCK特异性抗体免疫沉淀后,再以moesin特异性抗体做免疫印迹检测,结果显示在给予AGE-HSA刺激后,moesin的条带与无AGE-HSA刺激时明显减少。我们推测moesin与p-ROCK的结合减少,可能是moesin被磷酸化激活后脱离复合体而履行其连接蛋白的功能。3.成功构建moesin磷酸化位点突变质粒并在内皮细胞中表达经分子克隆及体外定点突变技术构建moesin磷酸化位点突变的真核表达质粒,抑制型突变体pcDNA3/HA-moesinT558A和激活型突变体pcDNA3/HA-moesinT558D分别以丙氨酸和天冬氨酸替代苏氨酸获得。经脂质体预转染内皮细胞24h,分别提取细胞总RNA和总蛋白,实时荧光定量PCR检测结果显示转染pcDNA3/HA-moesinT558A的内皮细胞moesin mRNA表达与对照组相比明显增高（P=0.001）,转染pcDNA3/HA-moesinT558D的moesin mRNA表达与对照组相比也明显增高（P=0.000）,免疫印迹结果显示转染pcDNA3/HA-moesinT558A和pcDNA3/HA-moesinT558D的内皮细胞均可检测到HA-moesin的表达,而未转染组未检测到。结果提示：构建了moesin磷酸化位点突变质粒,并在内皮细胞中成功表达。4.转染pcDNA3-HA-moesinT558A和pcDNA3-HA-moesinTS58D质粒对AGE-HSA介导的moesin磷酸化的影响与对照组相比,单独给予AGE-HSA刺激（P=0.001）或单独转染激活型突变体pcDNA3-HA-moesinT558D （P=0.002）, moesin磷酸化水平均升高。而转染抑制型突变体pcDNA3-HA-moesinT558A后,再给予AGE-HSA 50 mg/L刺激1 h,moesin磷酸化水平较单独给予AGE-HSA刺激组相比明显下降（P=0.015）（图16）。结果提示：pcDNA3-HA-moesinT558A能抑制AGE-HSA刺激诱导的moesin磷酸化,而pcDNA3-HA-moesinT558D则模拟了AGE-HSA刺激诱导的moesin磷酸化。5.转染pcDNA3-HA-moesinT558A和pcDNA3-HA-moesinT558D质粒对AGE-HSA介导的内皮细胞通透性改变及细胞骨架肌动蛋白F-actin形态及分布变化的影响（1）转染pcDNA3-HA-moesinT558A和pcDNA3-HA-moesinT558D质粒对AGE-HSA介导的内皮细胞通透性改变的影响单独给予AGE-HSA刺激内皮细胞通透性较正常对照组明显增高（P=0.000）,单独转染激活型突变体pcDNA3-HA-moesinT558D后,内皮细胞通透性较正常对照组组也明显增高（P=0.000）,而预先转染抑制型突变体pcDNA3-HA-moesinT558A,后给予AGE-HSA刺激,能够显著抑制AGE-HSA诱导的内皮细胞高通透性（P=0.000）,但仍未达到正常水平。而预先转染激活型突变体pcDNA3-HA-moesinT558D,后给予AGE-HSA刺激,能促进AGE-HSA引起的内皮细胞通透性增高。结果提示：pcDNA3-HA-moesinT558A能抑制AGE-HSA刺激诱导的内皮细胞高通透性,而pcDNA3-HA-moesinT558D则模拟了AGE-HSA刺激诱导的内皮细胞高通透性,并与AGE-HSA刺激有协同作用。（2）转染pcDNA3-HA-moesinT558A和pcDN A3-HA-moesinT558D质粒对AGE-HSA介导的内皮细胞细胞骨架肌动蛋白F-actin形态及分布变化的影响正常情况下,内皮细胞骨架F-actin主要分布在细胞周边,线条完整连续,显示出内皮细胞的典型鹅卵石样轮廓,单独给予AGE-HSA刺激或单独转染激活型突变体pcDNA3-HA-moesinT558D后,均可见F-actin在胞浆内弥散分布,形成非极性单行排列的应力纤维,而预先转染抑制型突变体pcDNA3-HA-moesinT558A,后给予AGE-HSA刺激,可见F-actin仍主要分布在细胞周边,但F-actin外周致密带不如正常组规整连续,相对弥散,但无明显应力纤维形成,与AGE-HSA组相比,有明显改善。结果提示：pcDNA3-HA-moesinT558A能抑制AGE-HSA刺激诱导的内皮细胞细胞骨架肌动蛋白F-actin形态及分布变化,而pcDNA3-HA-moesinT558D则模拟了AGE-HSA刺激诱导的内皮细胞细胞骨架肌动蛋白F-actin形态及分布变化。结论：1. AGE-HSA以时间和剂量依赖的方式引起内皮细胞RhoA活性增高。2. AGE-HSA通过激活RhoA活性进而导致其下游靶分子ROCK的磷酸化,并通过直接与moesin相互作用激活moesin,最终导致内皮细胞形态和功能的改变。3. AGE/ROCK介导下的moesin蛋白是通过第558位苏氨酸残基（moesinT558）磷酸化,进而发挥其在内皮细胞形态和功能改变中的作用,抑制该位点的磷酸化可改善这一病理过程。
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