人成肌细胞移植治疗肛门失禁的实验研究

论文摘要

肛门失禁或称大便失禁是指机体对直肠内液态和固态内容物以及气体的蓄控能力丧失,导致大便次数增多,轻者粪便泄出污染内裤,重者直肠内容物完全排出。虽然它并不危胁生命,但会给患者带来难言的身心痛苦和生活不便,严重影响患者生存质量。由于认识不足及诊断方法的缺乏,迄今这些问题仍被忽视,有报道约84.8%的失禁患者被漏诊。目前人群中的肛门失禁发病率报告差异很大,美国和欧洲报告的发生率为2%～7%,失禁率随着年龄增大和精神生理状态的下降而上升。正常人的大便节制主要通过下列机制调控:（1）直肠对膨胀压的感知,激发控制排便节制的动力学反应;（2）肛门内括约肌的张力,使肛管在大部分时间处于关闭状态;（3）肛门外括约肌和耻骨直肠肌的张力,使得在肛门内括约肌松弛期间,维持肛管直肠角的存在,并使肛管处于闭锁状态;（4）直肠适应性,使得在直肠内压不致过高情况下,允许直肠充盈,上述机制中一种或几种受到破坏,就可以引起大便失禁。目前治疗主要包括病因治疗、饮食治疗、括约肌收缩锻炼、心理治疗及生物反馈治疗等方式,对于内科治疗无效的患者需要行各种不同类型手术以加强括约肌,或植入人工肛门括约肌,但疗效并不理想,部分患者需行人工肛门,严重影响生活质量。随着人们对肛门自制机理的研究不断深入,肛门内括约肌在肛门自制中所起的作用日益得到了重视。肛门内括约肌是结肠环状平滑肌在肛门附近的增厚部分,其所产生的压力占肛管静息压的80%,而肛门静息压梯度是维持安静情况下肛门自制的主要因素之一,其使肛管在大部分时间处于关闭状态,尤其是对气体、液体的自制具有重要意义。对大便失禁者肛门内括约肌的超微结构研究发现:肛门内括约肌的平滑肌细胞缺失、剩余细胞的正常关系破坏、弹性组织拉伸、胶原纤维成分增加,因而大便溢漏最常见的原因是维持括约肌关闭的肌肉-肛门内括约肌的纤细平滑肌的退行性病变,肛管静息压降低是大便失禁发病的一个病理学机制。由于平滑肌组织损伤后无法自行修复,因此如果能够重建符合生理功能的肛门内括约肌,对节制排便必将具有重要意义。本课题主要研究目的:骨骼肌成肌细胞作为肌肉前体细胞,是成体骨骼肌中位于骨骼肌纤维肌浆膜和基底膜之间的具有增殖分化潜能的静止的肌源性干细胞,在骨骼肌细胞被破坏后,其可通过增殖、分化、融合形成肌管,从而修复损伤的肌肉组织。在目前成体内平滑肌前体细胞尚未明确的情况下,成肌细胞作为一种可能的平滑肌前体细胞,可被尝试用于重建肛门内括约肌治疗肛门失禁。众多的研究已经表明,人的成肌细胞能够在免疫缺陷小鼠或免疫抑制药物治疗的鼠体内存活。因此本实验将培养成人骨骼肌成肌细胞,用Ad-GFP在体外转染成肌细胞并检测其转染效率及对成肌细胞的增殖和分化影响,在体外研究的基础上,将转染Ad-GFP后的成人骨骼肌成肌细胞移植到免疫缺陷小鼠肛管直肠粘膜下层。观察移植细胞的存活及分化情况,并观察其对于肛门括约功能的作用。本课题主要研究方法:1、成人骨骼肌成肌细胞的体外培养及鉴定取成人长收肌,利用酶消化法和连续贴壁法分离成肌细胞,应用96孔培养板进行成肌细胞单克隆化培养,通过倒置相差显微镜观察培养细胞的生长状态,采用Desmin免疫荧光鉴定培养细胞类型。并观察冻存及复苏对成肌细胞增殖分化的影响。2. Ad-GFP转染成肌细胞及其对成肌细胞增殖及分化作用的研究以人胚胎肾293（HEK-293）细胞包装、扩增腺病毒Ad-GFP,测定病毒滴度,以MOI值为100的Ad-GFP转染体外单克隆培养的成肌细胞,细胞计数法分析转染率,倒置显微镜观察细胞形态学改变,CCK-8法检测细胞增殖活性。并观察转染了Ad-GFP后是否会对成肌细胞的分化融合有影响。3、转染Ad-GFP的成肌细胞在免疫缺陷小鼠直肠内移植的实验研究将20只免疫缺陷小鼠（SCID）随机分成2组（每组10只）,移植组肛管直肠粘膜下层注射转染Ad-GFP的成人成肌细胞,对照组注射PBS。所有实验动物术后继续观察4周。通过免疫荧光方法观察移植细胞存活和迁移情况,通过肛门静息压测量及肌电图测定观察成肌细胞移植对肛门括约功能的影响。本课题主要结果:1、体外分离培养的成人骨骼肌成肌细胞,多混杂有成纤维细胞的干扰,经过96孔培养板进行细胞单克隆化,成肌细胞纯度明显增高,经免疫组化鉴定纯度较高,能够传代扩增,并分化融合成具有收缩功能的成熟骨骼肌细胞。成肌细胞冻存、复苏后生长良好,仍可保持原有形态及增殖分化特性。2、腺病毒对细胞有很高的转染效率,MOI值为100时,转染率达80%以上。转染Ad-GFP后成人成肌细胞的增殖及分化能力与未转染细胞相比较,差异无显著性（P>0.05）。表明采用携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒表达载体标记成肌细胞的方法安全可靠、简便有效,且能保持成肌细胞原有生物学特性。3、移植组细胞移植后4周的检测结果显示:移植区周围弥漫分布绿色荧光区,移植的成肌细胞在移植区可存活并形成骨骼肌细胞。在肛门括约功能改善程度方面,肛门静息压及肌电图静息肌电振幅均增高,明显优于对照组（P<0.01）。表明骨骼肌成肌细胞移植具有改善肛门括约功能的作用。本课题主要结论:1、通过二步酶消化结合连续贴壁法分离的成人骨骼肌成肌细胞可以在体外进行培养扩增,应用96孔培养板进行细胞单克隆化后,经免疫组化检测提示培养细胞具有成肌细胞的特征,培养获得了纯度一致、稳定的细胞群体。2、Ad-GFP在体外既可以高效转染成肌细胞同时又对成肌细胞增殖分化能力影响较小,可作为适宜标记基因进行后续研究。3、体外培养扩增的骨骼肌成肌细胞可以在肛管直肠移植区存活,提高肛门静息压及静息肌电振幅水平,改善肛门括约功能。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 前言
• 第一部分 成人骨骼肌成肌细胞的体外培养及鉴定
• 一、材料
• （一） 实验材料
• （二） 主要仪器
• （三） 实验试剂
• （四） 主要试剂的配置
• 二、方法
• （一） 成人骨骼肌取材
• （二） 连续贴壁法筛选成人成肌细胞
• （三） 成人成肌细胞单克隆培养
• （四） 成人成肌细胞单克隆培养鉴定
• （五） 单克隆成人成肌细胞增殖、传代、冻存与复苏
• 三、结果
• （一） 成人成肌细胞原代连续贴壁筛选培养的观察
• （二） 成人成肌细胞单克隆培养筛选的观察
• （三） 成人成肌细胞的单克隆培养的鉴定
• （四） 单克隆成人成肌细胞冻存后的复苏
• 四、讨论
• 第二部分 Ad－GFP转染成肌细胞及其对成肌细胞增殖分化影响的实验研究
• 一、材料
• （一） 实验材料
• （二） 主要仪器
• （三） 实验试剂
• （四） 主要试剂的配置
• 二、方法
• （一） 人胚胎肾293细胞包装、扩增腺病毒Ad-GFP
• （二） 人成肌细胞的GFP转染
• （三） 统计学处理
• 三、结果
• （一） GFP 病毒载体扩增
• （二） 表达 Ad-GFP 的成人成肌细胞的形态变化
• （三） 成肌细胞的转染效率
• （四） 表达 Ad-GFP 的成人成肌细胞的增殖能力变化
• （五） 表达 Ad-GFP 的成人成肌细胞的分化能力变化
• 四、讨论
• 第三部分 转染 Ad－GFP 的成肌细胞在免疫缺陷鼠肛管直肠内移植的实验研究
• 一、材料
• （一） 实验材料
• （二） 主要仪器
• （三） 实验试剂
• （四） 主要试剂的配置
• 二、方法
• （一） 实验动物分组
• （二） 在体观测
• （三） 标本采集与检测
• （四） 统计学处理
• 三、结果
• （一） 肛门静息压测定
• （二） 肛门括约肌肌电图测定
• （三） 成肌细胞移植后在肛管直肠存活、迁移和分化
• 四、讨论
• 结论
• 附录 查新报告
• 文献综述
• 肛门失禁的诊治进展
• 成肌细胞的研究进展
• 参考文献
• 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明
• 致谢