AtmiR399f在番茄中的异位表达及功能分析

论文摘要

磷(P)是植物生长和发育所必需的重要元素,它在能量传递、信号转导、光合作用、呼吸作用中有着非常重要的作用,它还是核酸和磷脂的组成成分。在土壤中磷元素浓度对大多数作物而言是低于所需的。最近,在磷饥饿响应中发现了一种新型的调控因子—miR399。在拟南芥中过量表达miR399可提高嫩枝中磷元素含量和磷酸盐转运子基因的表达。小分子RNA在不同植物中的序列和功能都是高度保守的。为了研究miR399是否在番茄中也同样起作用,我们把拟南芥中AtmiR399f前体用农杆菌介导法转入番茄用来检测miR399在番茄中的功能。结果发现两个转基因株系的茎粗均增加,产生的种子比对照大,转基因番茄根的构型也发生了改变。转基因番茄的根系具有丰富的侧根从而加强了对低磷的耐受性。我们还发现过量表达miR399可使转基因番茄中乙烯合成相关基因表达量明显上升。

论文目录

• 英文缩略表
• 中文摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 植物必需元素—磷
• 1.1.1 磷的重要性
• 1.1.2 磷的有效性
• 1.1.3 植物对低磷的响应机制
• 1.1.3.1 低磷下根系的变化
• 1.1.3.2 低磷诱导有机酸分泌
• 1.1.3.3 低磷对植物生理生化的影响
• 1.1.3.4 低磷和miR399
• 1.2 植物小分子RNA
• 1.2.1 植物miRNA 的特征
• 1.2.2 植物microRNAs 的发生及其作用机制
• 1.2.3 植物microRNAs 的功能
• 1.2.3.1 miRNA 的负反馈调节
• 1.2.3.2 miRNA 负责mRNA 的剪切
• 1.2.3.3 miRNA 参与植物形态建成
• 1.3 低磷和植物激素—乙烯
• 1.3.1 乙烯的特征
• 1.3.2 乙烯的发现历程
• 1.3.3 乙烯的生物合成
• 1.3.4 乙烯的生理功能
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 酶及生化试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 PCR 引物
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 CTAB 法提取RNA
• 2.2.2 RNA 含量和纯度检测
• 2.2.3 cDNA 第一链的合成
• 2.2.4 反转录产物质量检测
• 2.2.5 CTAB 法提取DNA
• 2.2.6 PCR 扩增条件和程序
• 2.2.6.1 AtmiR399f 前体的PCR 扩增条件和程序
• 2.2.7 PCR 扩增产物的回收
• 2.2.8 PCR 产物的克隆
• 2.2.8.1 大肠杆菌DH-5α感受态细胞的制备
• 2.2.8.2 重组载体的构建
• 2.2.8.3 重组载体转化感受态细胞
• 2.2.8.4 阳性克隆的筛选
• 2.2.9 cDNA 序列测定
• 2.2.10 质粒DNA 的酶切鉴定
• 2.2.11 根癌农杆菌LBA4404 感受态细胞的制备与转化
• 2.2.11.1 农杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.11.2 电转法转化农杆菌
• 2.2.12 正义表达载体 PBI121-AtmiR399f 的构建
• 2.2.13 农杆菌介导的番茄转化
• 2.2.14 番茄继代培养
• 2.2.15 转基因番茄的鉴定
• 2.2.16 低磷处理转基因番茄
• 2.2.16.1 MS 培养基低磷处理
• 2.2.16.2 水培低磷处理
• 3 结果与分析
• 3.1 番茄中miR399 受低磷诱导
• 3.1.1 RNA 的提取和质量检测
• 3.1.2 反转录产物质量检测
• 3.2 拟南芥AtmiR399f 前体片段的扩增
• 3.2.1 拟南芥DNA 的提取
• 3.2.2 AtmiR399f 前体片段的扩增
• 3.3 表达载体 PBI121- AtmiR399f 的构建
• 3.4 AtmiR399f 侵染番茄分化、抗性小苗的获得及转基因株系的鉴定
• 3.4.1 番茄分化和抗性小苗的获得
• 3.4.2 AtmiR399f 转基因番茄株系的鉴定
• 3.4.3 过量表达miR399 影响番茄根系的构型
• 3.4.4 转基因株系的茎粗增加
• 3.4.5 转基因株系的种子增大
• 3.4.6 miR399 正调控乙烯相关基因的表达
• 4 讨论
• 4.1 AtmiR399f 转基因番茄的表型特征
• 4.2 miR399 正调控乙烯相关基因的表达
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 硕士学位论文内容简介及自评