重组猪生长素基因工程菌培养基优化及高密度液体发酵研究

论文摘要

目前毕赤酵母发酵罐发酵培养,大多数依然采用invitrogen公司毕赤酵母发酵工艺手册上提供的基础盐培养基或BMGY/BMMY培养基。基础盐培养基成分复杂,主要以盐类元素为主,营养单一,且价格相对较高,尤其是这类培养基不能混合高温灭菌,否则容易形成沉淀。本研究优化了工程菌发酵罐发酵培养基,同时在摇瓶基础上优化了工程菌发酵罐发酵工艺。减少了猪生长素工业生产成本。（1）本研究以马铃薯渣水解液做基础C源,以豆渣水解液做基础N源,用正交实验对猪生长素毕赤酵母工程菌培养基进行优化,结果,100ml优化培养基马铃薯渣水解液用量为12ml,豆渣水解液用量是25ml,K2HPO4用量为0.5g,麦麸水用量为0.8ml。用这种培养基优化培养经过筛选的高产重组猪生长素基因工程菌,经过60h诱导,最终收获上清中总蛋白量可达到78.4mg/L。用麦芽汁培养基经过相同培养及诱导条件,测定最终收获上清中总蛋白量为88.4mg/L。且这样经过优化的适宜于毕赤酵母工程菌生长及表达的培养基是麦芽汁培养基培养基成本的2.3%。比BMGY/BMMY培养基成本降低了8642.6倍。大大降低了工业生产成本。获得优质且廉价的工业用高密度液体发酵培养基。（2）)通过对接种量,诱导时间,初始pH等条件的研究,确定了适合基因工程菌毕赤酵母GSll5的最优发酵条件。即:接种量为l0%,初始pH8.0,诱导时间60h收获。在此条件下发酵上清液中蛋白总浓度为78.4mg/L。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩写词表（ABBREVIATIONS）
• 第1章 绪论
• 1.1 我国在生长素（growth hormone GH）方面的研究进展
• 1.2 猪生长激素（pGH）基因的结构特点、定位及遗传连锁分析
• 1.3 pGH 基因的作用机理及表达调控
• 1.4 猪生长激素的生理功能
• 1.4.1 pGH 对类胰岛素生长因子Ⅰ（Insulin-like growth factors IGF-Ⅰ）、类胰岛素生长因子Ⅱ（Insulin-like growth factors IGF-Ⅱ）和胰岛素分泌及葡萄糖浓度的影响
• 1.4.2 pGH 对蛋白质合成的影响
• 1.4.3 pGH 对脂肪合成的影响
• 1.4.4 pGH 对矿物代谢的影响
• 1.4.5 猪生长激素的分泌规律
• 1.5 猪生长激素抗体及其与猪生长激素的相互作用
• 1.6 pGH 最新应用研究
• 1.6.1 利用pGH 的皮下控释给药技术进行研究
• 1.6.2 利用脂质体包被技术进行研究
• 1.7 pGH 的社会及经济意义
• 1.8 毕赤酵母中基因的表达
• 1.8.1 大肠杆菌中基因表达的限制及毕赤酵母表达系统的优点
• 1.8.2 影响目的基因在毕赤酵母中表达的因素
• 1.8.3 毕赤酵母表达系统的特点
• 1.8.4 毕赤酵母及载体
• 1.8.6 毕赤酵母表达菌的生长特性
• 1.8.7 培养条件对毕赤酵母工程菌外源基因高密度发酵表达的影响
• 1.9 本研究的背景和拟研究的主要内容
• 第2章 猪生长素毕赤酵母基因工程菌高产菌株筛选、发酵罐液体发酵及喂饲实验
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 喂饲实验材料
• 2.1.3 主要试剂药品
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.1.5 培养基
• 2.1.6 主要试剂配方
• 2.2 方法
• 2.2.1 生物量测定
• 2.2.2 蛋白质浓度测定
• 2.2.3 猪生长素基因工程酵母菌高产菌株的筛选
• 2.2.3.1 猪生长素基因工程酵母菌高产菌株的PCR 鉴定
• 2.2.3.2 猪生长素基因工程酵母菌高产菌株SDS-PAGE 筛选
• 2.2.4 猪生长素基因工程酵母菌高产菌株发酵罐发酵
• 2.2.5 pGH 喂饲实验
• 2.3 结果
• 2.3.1 猪生长素基因工程酵母菌高产菌株的PCR 鉴定
• 2.3.2 猪生长素基因工程酵母菌高产菌株的SDS-PAGE 筛选
• 2.3.3 pGH 喂饲实验
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 第3章 毕赤酵母工程菌培养基优化及摇瓶发酵条件探索
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 主要仪器
• 3.1.3 主要试剂配方
• 3.2 方法
• 3.2.1 培养基配置原则
• 3.2.2 毕赤酵母工程菌培养基C 源-马铃薯渣酸水解
• 3.2.2.1 酸浓度对马铃薯渣水解上清总还原糖重量的影响
• 3.2.2.2 酸固比对马铃薯渣水解上清总还原糖重量的影响
• 3.2.2.3 水解时间对马铃薯渣水解上清总还原糖重量的影响
• 3.2.2.4 水解温度对马铃薯渣水解上清总还原糖重量的影响
• 3.2.2.5 正交试验确定马铃薯渣最佳水解条件
• 3.2.3 毕赤酵母工程菌培养基N 源-豆渣碱水解
• 3.2.4 毕赤酵母工程菌pPGHA-01 培养基优化配比
• 3.2.5 pPGHA-01 工程菌马铃薯渣-豆渣培养基摇瓶发酵条件探索
• 3.2.5.1 培养基初始pH 值对蛋白总产量的影响
• 3.2.5.2 接种量对蛋白总产量的影响
• 3.2.5.3 发酵温度对蛋白总产量的影响
• 3.2.5.4 培养基装液量对蛋白总产量的影响
• 3.2.5.5 诱导时间对蛋白总产量的影响
• 3.2.5.6 毕赤酵母工程菌pPGHA-01 在种子培养基BMGY 中生长曲线
• 3.2.6 pPGHA-01 工程菌马铃薯渣豆渣培养基摇瓶发酵验证
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 毕赤酵母工程菌培养基C 源-马铃薯渣酸水解结果与分析
• 3.3.1.1 酸浓度对马铃薯渣水解上清总还原糖重量的影响
• 3.3.1.2 酸固比对马铃薯渣水解上清总还原糖重量的影响
• 3.3.2 毕赤酵母工程菌培养基N 源-豆渣碱水解
• 3.3.3 毕赤酵母工程菌pPGHA-01 培养基优化
• 3.3.4 毕赤酵母工程菌pPGHA-01 马铃薯渣豆渣摇瓶发酵条件探索
• 3.3.4.1 培养基初始pH 值对蛋白总产量的影响
• 3.3.4.2 接种量对蛋白总产量的影响
• 3.3.4.3 发酵温度对蛋白总产量的影响
• 3.3.4.4 培养基装液量对蛋白总产量的影响
• 3.3.4.5 诱导时间对蛋白总产量的影响
• 3.3.4.6 毕赤酵母工程菌pPGHA-01 在种子培养基BMGY 中生长曲线
• 3.3.4.7 pPGHA-01 工程菌马铃薯渣-豆渣培养基摇瓶发酵验证
• 3.3.4.8 马铃薯渣-豆渣培养基成本核算
• 3.4 本章讨论与小结
• 主要结论
• 不足与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录A：攻读学位期间所发表的学术论文及成果
• 附录B：合成的猪生长素cDNA 序列