论文题目: 毛白杨纤维素合成酶基因的克隆及功能鉴定
论文类型: 博士论文
论文专业: 林木遗传
作者: 李春秀
导师: 张守攻,齐力旺
关键词: 毛白杨,基因克隆,表达载体,纤维素合成酶基因,遗传转化,烟草
文献来源: 中国林业科学研究院
发表年度: 2005
论文摘要: 杨树是林木遗传育种和分子生物学研究的模式植物,阐明杨树纤维素生物合成的分子机理对于林木纤维素的分子改良具有非常重要的现实意义。目前,国际上已从欧洲颤杨克隆出七个纤维素合成酶基因,但有关这些基因的功能鉴定和相互作用机制尚未见研究报道。为此,本研究以毛白杨次生木质部为材料,通过RT-PCR克隆了纤维素合成酶PtoCesA1全长基因和PtoCesA2,PtoCesA3的基因片段,利用转基因手段,获得了各基因的转基因植株,根据转基因植株的表型,分析了各基因的功能及其相互作用关系,以上研究的主要结果有: 1) 以毛白杨次生木质部区域的组织为材料提取RNA,合成双链cDNA,并克隆出毛白杨纤维素合成酶全长基因(PtoCesA1)。序列分析表明该基因长度为3215bp,与已报道的欧洲颤杨的ptrCesA1基因的同源性为98%。具有开放的阅读框,编码区在52-2985碱基之间,长度为2925bp。2) 设计与植物表达载体pBI121多克隆位点相匹配的双酶切位点引物,将PtoCesA1不同区段的基因片段PR,PF,CC1,BR反向连接到pBI121载体上,构建了pBIPF,pBICC1,pBIPR,pBIBR四个反义表达载体。利用根癌农杆菌介导方法分别转化烟草和杨树,获得杨树转基因植株和烟草转基因成熟植株。其中pBIPF转基因烟草表型与对照相同;而pBICC1,pBIPR,pBIBR转基因烟草表型发生了明显的变化,表现为成熟植株瘦小,次生木质部厚度和纤维细胞壁厚度减小以及茎纤维素含量下降等特征,CC1,PR,BR片段的反义表达抑制了纤维素的生物合成而抑制了烟草的正常生长,尤其是木质部的发育,说明PtocesA1的基因功能是参与次生木质部次生壁的纤维素的合成,;此外,这三个表达载体的转基因烟草之间的表型差异不显著,说明在本试验中基因片段的长度对其反义转基因烟草的表型影响不显著。3) 通过同义突变引入BamHI酶切位点,分两步构建了全长PtoCesA1的正义表达载体pBIPA1,并通过根癌农杆菌介导转化烟草和杨树,获得了杨树转基因植株和烟草成熟植株。转基因烟草表现为植株明显变矮,叶片变小,木质部厚度,纤维细胞壁厚度减少。pBIPA1转基因烟草的表型与PtoCesA1的反义转基因烟草之间的表型差异不显著。4) 以毛白杨次生木质部cDNA为模板,克隆PA2(PtoCesA2)和PA3(PtoCesA3)基因片段(815bp 和381bp)。两个片段与欧洲颤杨中PtrCesA2和PtrCesA3的同源性高达98%。并利用PA2和PA3片段分别构建了反义表达载体
论文目录:
摘要
关键词
Abstract
引言
1 文献综述
1.1 纤维素生物合成研究进展
1.1.1 纤维素的结构及其作用
1.1.2 纤维素体外合成的研究概况
1.1.3 植物纤维素生物合成途径研究进展
1.2 植物纤维素合成酶基因研究进展
1.2.1 植物纤维素合成酶基因的发现
1.2.2 纤维素合成酶的超家族(supper-family)
1.2.2.1 植物纤维素合成酶的基因结构
1.2.2.2 纤维素合成酶相似蛋
1.2.2.3 CesA 与Csl 蛋白的超家族
1.2.3 植物纤维素合成酶的表达规律
1.2.4 与纤维素生物合成的关系
1.2.5 纤维素的生物合成需要多个纤维素合成酶基因的共同参与
1.2.6 纤维素合成酶功能的研究方法
1.2.7 参与纤维素生物合成的其它基因
1.2.8 微纤丝排布与纤维素合成酶基因的关系
1.3 林木纤维素合成酶基因研究进展
1.4 问题与展望
1.5 本研究拟解决的问题
2 毛白杨纤维素合成酶基因(PtoCesA1)基因组DNA 片段的克隆与鉴定
2.1 实验材料与试剂
2.1.1 实验材料
2.1.2 仪器与试剂
2.2 实验方法
2.2.1 引物设计
2.2.2 毛白杨幼叶 DNA 的提取
2.2.3 PtoCesA1 基因组DNA 片段的PCR 扩增
2.2.4 目的扩增片段的回收
2.2.5 目的片段连接转化测序
2.2.6 测序结果的分析方法
2.3 结果与分析
2.4 讨论
2.5 小结
3 毛白杨纤维素合成酶基因(PtoCesA1)的cDNA 克隆与鉴定
3.1 材料与方法
3.1.1 实验材料
3.1.1.1 植物材料
3.1.1.3 仪器与试剂
3.1.2 研究方法与步骤
3.1.2.1 毛白杨次生木质部组织RNA 的提取
3.1.2.2 毛白杨双链cDNA 的合成
3.1.2.3 PCR 扩增PtoCesA1 基因
3.1.2.4 目的DNA 片段的回收
3.1.2.5 目的DNA 片段与pGEM-T Easy 载体的连接
3.1.2.6 连接产物的转化
3.1.2.7 白斑PCR 筛选
3.1.2.8 质粒DNA 的快速提取-----Clark M.S 等(1998)方法
3.1.2.9 测序及序列分析方法
3.2 结果与分析
3.2.1 毛白杨双链cDNA 的合成
3.2.2 毛白杨PtoCesA1 基因的cDNA 克隆
3.3 讨论
3.4 本章小结
4 PtoCesA1 反义表达载体的构建及遗传转化
4.1 材料与方法
4.1.1 材料与试剂
4.1.1.1 菌株和载体
4.1.1.2 试剂
4.1.2 实验方法
4.1.2.1 不同PtoCesA1 基因片段的扩增和鉴定
4.1.2.2 反义表达载体的构建
4.1.2.3 表达载体向农杆菌的转化
4.1.2.4 根癌农杆菌介导的遗传转化和转基因植株再生
4.1.2.5 转基因植株的分子检测
4.1.2.6 转基因烟草的表型测定
4.2 结果与分析
4.2.1 PtoCesA1 反义表达载体的构建策略及酶切鉴定
4.2.2 反义转基因烟草和杨树的检测
4.2.2.1 PCR 分子检测
4.2.2.2 Southern 杂交鉴定
4.2.3 反义PtoCesA1 转烟草的表型
4.2.3.1 反义转烟草的基本形态指标
4.2.3.2 反义转基因烟草的次生木质部结构
4.2.3.3 反义转基因烟草茎部组织纤维细胞的形态特征
4.2.3.4 反义转基因烟草的茎部纤维细胞壁的厚度
4.2.3.5 PtoCesA1 反义烟草的纤维素含量和木质素含量
4.3 讨论
4.3.1 表达载体的遗传转化和转基因植株再生
4.3.2 PtoCeaA1 反义烟草的特征与功能分析
4.3.3 不同部位的PtoCesA1 基因片段构建的反义表达载体抑制效率.
4.3.4 同一基因的不同长度基因片段构建的反义表达载体对转基因烟草特征的影响不显著
4.3.5 为林木的纤维素合成酶基因的功能及相互作用机制提供了一个新的平台
4.4 小结
5 毛白杨PtoCesA1 基因正义表达载体的构建与遗传转化
5.1 材料与方法
5.1.1 材料与试剂
5.1.1.1 菌株和载体
5.1.1.2 试剂
5.1.2 实验方法
5.1.2.1 正义表达载体的构建步骤
5.1.2.2 质粒pBIPA1 转化农杆菌与遗传转化
5.1.2.3 转基因植株的分子检测
5.1.2.4 转基因阳性烟草的表型测定
5.2 结果与分析
5.2.1 PtoCesA1 基因正义植物表达载体的构建
5.2.2 重组质粒pBIPA1 的PCR 鉴定和酶切鉴定
5.2.3 转基因烟草的分子检测
5.2.3.1 PCR 分子检测结果
5.2.3.2 Southern 杂交结果
5.2.4 pBIPA1 转基因烟草的特征
5.2.4.1 pBIPA1 转基因烟草的形态指标
5.2.4.2 pBIPA1 转基因烟草纤维细胞的长度、宽度和细胞壁厚度
5.3 讨论
5.4 小结
6 PtoCesA2,ptoCesA3 反义表达载体的构建及遗传转化
6.1 材料与方法
6.1.1 材料与试剂
6.1.1.1 实验材料
6.1.1.2 试剂
6.1.2 实验方法
6.1.2.1 引物设计
6.1.2.2 基因的克隆与测序鉴定
6.1.2.3 pBIPA2,pBIPA3 反义表达载体的构建
6.1.2.4 pBIPA2+PA3 表达载体的构建及遗传转化
6.1.2.5 农杆菌转化
6.1.2.6 根癌农杆菌介导的遗传转化和转基因植株再生
6.1.2.7 转基因植株的分子检测
6.1.2.8 转基因烟草的表型特征测定
6.2 结果与分析
6.2.1 PtoCesA2,PtoCesA3 基因片段的克隆与鉴定
6.2.2 PtoCesA2,PtoCesA3 基因反义表达载体的构建
6.2.3 pBIPA2+PA3 反义表达载体的构建
6.2.4 pBIPA2,pBIPA3,pBIPA2+PA3 基因植株的分子检测
6.2.4.1 PCR 检测结果
6.4.2.2 Southern 杂交结果
6.2.5 pBIPA2,pBIPA3,pBIPA2+PA3 转基因烟草的表型
6.2.5.1 pBIPA2,pBIPA3,pBIPA2+PA3 转基因烟草的形态指标.
6.2.5.2 转基因烟草的次生木质部结构
6.2.5.3 转基因烟草纤维细胞的长度和宽度
6.2.5.4 转基因烟草的纤维细胞壁厚度
6.3 讨论
6.3.1 PtoCeaA2 反义转基因烟草的表型与功能分析
6.3.2 PtoCesA3 反义转基因烟草的表型与功能分析
6.3.3 PtoCesA1,PtoCesA2,PtoCesA3 反义转基因烟草的表型与相互作用机制分析
6.4 本章小结
7 结论
7.1 PtoCesA1 全长基因的克隆与功能分析
7.2 PtoCesA2,PtoCesA3 基因片段的克隆与功能分析
7.3 PtoCesA1,PtoCesA2 和PtoCesA3 的相互作用机制的分析
7.4 林木纤维素合成酶基因功能的研究平台的建立
参考文献
附录1 转基因杨树植株
附录2 图表目录
附录3
致谢
发布时间: 2005-10-11
参考文献
- [1].毛白杨PtSEP3基因参与开花诱导和次生生长的调控作用研究[D]. 郭伟.中国林业科学研究院2012
- [2].毛白杨4CL基因启动子及APX的结构与功能研究[D]. 潘翔.北京林业大学2013
- [3].白桦木质素合成苯丙氨酸途径相关酶基因的表达和功能分析[D]. 宋福南.东北林业大学2009
- [4].慈竹CBF1基因克隆及其耐寒性研究[D]. 蒋瑶.四川农业大学2012
相关论文
- [1].毛竹纤维素生物合成相关基因研究[D]. 袁丽钗.中国林业科学研究院2009
- [2].大青杨纤维素合酶基因的克隆与遗传转化的研究[D]. 许雷.东北林业大学2011
- [3].杨树木质素合成酶PAL基因的克隆、鉴定及其表达载体的构建[D]. 薛永常.中国林业科学研究院2001
- [4].白桦木质素生物合成酶基因分离及遗传转化的研究[D]. 刘雪梅.东北林业大学2005
- [5].柽柳抗逆分子机理研究与相关基因的克隆[D]. 王玉成.东北林业大学2005
- [6].天花粉蛋白基因表达载体的构建及转化杨树的研究[D]. 邹莉.东北林业大学2005
- [7].毛白杨维管系统再生过程中的基因表达分析[D]. 王敏杰.中国林业科学研究院2005
- [8].杨树4CL基因调控木质素生物合成的研究[D]. 李金花.中国林业科学研究院2005
- [9].PtIAA1和PtABP1基因的克隆及其在杨树中的表达[D]. 赵树堂.中国林业科学研究院2006
- [10].毛白杨木材形成相关基因的克隆及在烟草和杨树中的表达[D]. 张德强.中国林业科学研究院2004