苏太猪肌内脂肪含量cDNA-AFLP研究

论文摘要

肌内脂肪（IMF）含量是肉质的一个非常重要的指标,直接影响猪肉的嫩度和风味。随着IMF含量的增加会使肉质的嫩度和多汁性得到相应改进。大量的研究结果表明,2%～3%的肌内脂肪含量是新鲜肉品的一个理想标准。长期以来猪的遗传育种工作一直将提高瘦肉率或降低背膘厚作为主要目标之一,由于肌内脂肪含量与瘦肉率之间呈负相关,因此,这种选育方式的最终结果是导致肌内脂肪含量的下降,以及猪肉品质的下降。另一方面,那些未经选育或选育程度较低的地方猪种具有较高的肌内脂肪含量,肉的品质也较好,但瘦肉率却普遍较低。因此如何在瘦肉率不降低或背膘厚不增加的前提下,对已有的高瘦肉率猪种选育,提高肌内脂肪含量是目前猪种选育的一个主要方向。目前,从分子水平上进行猪品种选育已成为可能,但对于肌内脂肪沉积的分子调节机制了解还不清楚。本文旨在通过cDNA扩增片段长度多态性（cDNA-AFLP）分离与肌内脂肪含量差异表达相关的基因。其目的在于寻找参与肌内脂肪沉积调控的相关基因,并为猪的肌内脂肪性状选育提供候选标记基因,为今后猪种选育工作提供科学依据。从平均肌内脂肪含量为2.72±0.13%的90头180日龄苏太猪中各选取平均肌内脂肪含量差异极显著（P＜0.01）的最高（5.79±0.35%）和最低（0.98±0.09%）各6头构建RNA池。采用cDNA扩增片段长度多态性（cDNA-AFLP）检测两组基因间的差异表达。本实验用72对EcoR I/Taq I引物组合检测到200多条差异条带,回收克隆测序获得15条EST序列,通过NCBI比对发现有4条为已知序列,其余为未知序列。4条已知序列中,有一条为猪的NADH4基因,经测序比对发现肌内脂肪含量高组多了一个EcoR I限制性酶切位点。为了验证是否存在酶切位点进行了PCR-RFLP,结果发现肌内脂肪高组存在这一酶切位点,而肌内脂肪含量低组没有发现这一酶切位点。为了进一步的验证NADH4基因与肌内脂肪之间的关系,从90个个体中选取肌内脂肪最高和最低的各15头组成肌内脂肪含量差异显著的两组（p＜0.05）,肌内脂肪平均含量分别位4.46±0.29%和1.65±0.16%,首次对其进行实时定量PCR检测。定量结果显示NADH4基因的表达量与肌内脂肪沉积量负相关,并且两组间表达差异极显著（P＜0.01）,NADH4可能参与了肌内脂肪沉积的负调节。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.苏太猪的选育及生产性能
• 2.肌内脂肪沉积的相关性研究进展
• 2.1 肌内脂肪代谢研究进展
• 2.2 肌内脂肪沉积相关基因的研究进展
• 3.基因差异表达的分离方法研究进展
• 3.1 mRNA差异显示（DDRT）
• 3.2 抑制性消减杂交（SSH）
• 3.3 基因表达系列分析法（SAGE）
• 3.4 cDNA微阵列
• 3.5 实时定量PCR（Real-TimeQuantitativePCR）
• 3.6 cDNA代表性差异分析技术
• 3.7 cDNA扩增片段长度多态性（cDNA-AFLP）
• 3.8 cDNA-AFLP在动物遗传育种中的应用
• 第二章 苏太猪cDNA-AFLP试验
• 1 实验材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要仪器设备
• 1.3 主要试剂及试剂盒
• 1.4 主要溶液及其配制
• 2 试验方法
• 2.1 肌内脂肪组织RNA的提取及检测
• 2.2 RNA的纯化
• 2.3 双链cDNA的合成及其精制
• 2.4 cDNA-AFLP
• 2.5 差异条带的回收、二次PCR及其纯化
• 2.6 差异片段的克隆测序
• 3 结果与分析
• 3.1 总RNA的提取结果
• 3.2 预扩增结果
• 3.3 选择性扩增结果
• 3.4 差异片段的回收、克隆及PCR鉴定
• 3.5 差异片段的序列测定及分析
• 4 讨论
• 第三章 NADH4基因的PCR-RFLP及实时定量-PCR分析
• 1 试验材料
• 1.1 试验动物
• 1.2 试验试莉
• 1.3 仪器设备
• 2 试验方法
• 2.1 背最长肌肌内脂肪组织RNA的提取及检测
• 2.2 反转录
• 2.3 NADH4基因的扩增及PCR产物的酶切
• 2.4 NADH4基因实时定量-PCR分析
• 3.结果
• 3.1 酶切结果
• 3.2 实时定量-PCR结果
• 4 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 1.测序结果及测序图
• 致谢
• 攻读硕士期间发表的学术论文