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钩吻化学成分UAE和ZCU抗肿瘤活性及作用机制研究

2020-11-22阅读(453)

钩吻化学成分UAE和ZCU抗肿瘤活性及作用机制研究

论文摘要

钩吻为马钱科（Loganiacease）植物胡蔓藤（Gelsemium elegans Benth，GEB）的全草，是世界著名的剧毒植物，具有镇痛、抗肿瘤等作用。本文对钩吻非生物碱组分进行了分离和追踪，得到两个活性化合物：钩藤酸（uncarinic acid E，UAE）和3β-羟基-27-p-（E）-桂皮酰基齐墩果酸（3β-hydroxy-27-p-（Z）-coumaroyloxyursan-12-en-28-oic acid，ZCU），并对其诱导HepG2和KB细胞死亡的机制进行了较为系统的研究。实验结果表明，钩吻非生物碱不同组分具有体内抗肿瘤作用，并能增加荷瘤小鼠的免疫功能，体内外毒性结果相一致。研究发现UAE和ZCU抑制了几种肿瘤细胞的生长，其中包括：黑色素瘤细胞（A375-S2），人乳腺癌细胞（MCF-7，包括抗药株）、人胃腺癌细胞（SGC-7901），人口腔上皮癌KB细胞及人肝癌HepG2细胞。但UAE和ZCU对小鼠骨髓细胞和人外周血单核细胞均有促进增长作用，对人的正常脾细胞及诱导分化的T细胞和B细胞的生长影响较小，表明UAE和ZCU在具有抗肿瘤活性的同时，对正常细胞具有较低的毒性或有免疫增强作用。在UAE诱导HepG2细胞死亡中，电镜和DNA片断化分析证明，UAE能够引起HepG2细胞凋亡。UAE激活了Caspase-3，-6，以Caspase特异性的方式劈开Caspase的底物PARP，Caspase-3裂解为活性物。LDH活力分析表明，UAE诱导的细胞死亡为凋亡和坏死同时存在，流式细胞结果也给出了相同的结论。UAE上调了p53蛋白的表达水平，阻滞细胞周期停滞在G0／G1期，上调了Bax蛋白的表达，同时下调了Bcl-2和Bcl-XL蛋白的表达，这与p53的激活密切相关。激活后的Bax引起了线粒体膜通透性的改变，促进了细胞色素c的释放，进而导致Caspase的激活，这一过程可被MEK的抑制剂PD98059和P13K抑制剂Wortmaninin阻止，表明ERK和p53为诱导细胞凋亡的中间重要环节；而PKC促进剂PMA能够反转UAE诱导的细胞死亡。ZCU在诱导KB细胞死亡中，经历了经典的凋亡途径。Caspase抑制剂有效的阻止了ZCU诱导的细胞凋亡，而细胞坏死也同时发生。ZCU抑制了ERK的表达而激活了p38的表达，Wortmannin能有效抑制细胞死亡。形态学变化及DNA电泳都证明了ZCU能够诱导KB细胞的凋亡。p53积累及MARP家族中ERK抑制和p38激活引起了线粒体Bax与Bcl-xL，Bcl-2改变。表明ERK作用于p53的上游，p53和MAPK家族在细胞凋亡中起到重要作用。PKC可能是ZCU作用的上游蛋白。综合UAE和ZCU对HepG2和KB细胞作用结果的分析，UAE和ZCU诱导细胞凋亡的信号转导途径为：UAE和ZCU抑制了PLCγ1，减少了IP3和DAG的产生，引起PKC抑制，同时引起DNA损伤，进一步通过ATM途径和PI3K途径，分别激活p53和抑制Ras-Raf-MEK途径，引起线粒体膜Bax／Bcl-2和Bax／Bcl-xL比例改变，细胞色素c释放，激活Caspase-3，Caspase-6而引起Caspase级联反应，导致DNA断裂，细胞凋亡。同时ERK，p38与p53之间存在交互作用。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 第一章 前言
  • 一 抗肿瘤药物研究进展
  • 二 天然药物抗肿瘤的研究进展
  • 1 临床常用的抗肿瘤天然药物
  • 2 提取分离抗癌天然药物活性成分
  • 2.1 生物碱类活性成分
  • 2.2 萜类活性成分
  • 2.3 多糖类活性成分
  • 2.4 苷类活性成分
  • 2.5 蛋白类活性成分
  • 2.6 蟾蜍甾二烯类活性成分
  • 2.7 黄酮类活性成分
  • 2.8 醌类活性成分
  • 2.9 挥发油类活性成分
  • 2.10 有机酸类活性成分
  • 2.11 其它类活性成分
  • 3 中药治疗肿瘤的机理探讨
  • 3.1 促进细胞凋亡作用
  • 3.2 诱导分化作用
  • 3.3 免疫增强作用
  • 3.4 影响拓扑异构酶
  • 3.5 抗血管生成
  • 3.6 抑制微管蛋白活性
  • 3.7 逆转多药耐药
  • 3.8 抑制端粒酶活性
  • 第二章 钩吻中非生物碱组分抗肿瘤作用研究
  • 第一节 钩吻研究进展
  • 一 钩吻化学成分的研究
  • 二 钩吻药理作用及临床应用
  • 1 抗肿瘤作用
  • 2 抗炎镇痛作用
  • 3 免疫调节作用
  • 4 对心血管系统的作用
  • 5 造血保护作用
  • 6 扩瞳作用
  • 7 畜禽复壮作用
  • 三 毒理作用
  • 第二节 钩吻中非生物碱不同组分体内外抗肿瘤对比研究
  • 一 材料和方法
  • 1 实验材料
  • 2 实验方法
  • 二 实验结果
  • 1 急性毒性实验结果
  • 2 生物碱与非生物碱体外活性对比
  • 3 体外追踪不同组分活性
  • 4 非生物碱各组分对H22肝癌荷瘤小鼠的影响
  • 5 非生物碱各组分对H22肝癌荷瘤小鼠免疫器官的影响
  • 6 非生物碱各组分对H22肝癌荷瘤小鼠白细胞的影响
  • 三 讨论
  • 四 小结
  • 第三章 钩藤酸E抗肿瘤机制研究
  • 一、实验材料
  • 二、实验方法
  • 三、实验结果
  • 3.1 钩藤酸E对肿瘤细胞的细胞毒活性
  • 3.2 钩藤酸E诱导HepG2细胞死亡呈明显的时间和剂量依赖性
  • 3.3 内毒素并未参与钩藤酸E的细胞毒作用
  • 3.4 钩藤酸E对小鼠骨髓细胞的影响
  • 3.5 钩藤酸E对胎脾淋巴细胞的影响
  • 3.6 钩藤酸E对人外周血单核细胞（PBMC）的影响
  • 3.7 钩藤酸E对耐药细胞株MCF-7的影响
  • 3.8 钩藤酸E诱导HepG2细胞凋亡的形态学变化
  • 3.9 钩藤酸E对HepG2细胞的电镜观察
  • 3.10 钩藤酸E诱导凋亡性的细胞死
  • 3.11 钩藤酸E诱导HepG2细胞死亡对细胞周期的影响
  • 3.12 乳酸脱氢酶活力测定证明钩藤酸E诱导HepG2细胞死亡通过凋亡与坏死途径
  • 3.13 PKC激酶对钩藤酸E诱导HepG2细胞死亡的影响
  • 3.14 钩藤酸E诱导HepG2凋亡经过caspase激活
  • 3.15 Bcl-2家族成员和细胞色素c对钩藤酸E诱导HepG2细胞凋亡的影响
  • 3.16 p53和ERK在钩藤酸E诱导HepG2细胞凋亡中的调节作用
  • 四、讨论
  • 第四章 钩藤酸E诱导人口腔上皮癌KB细胞凋亡机制研究
  • 一、实验材料
  • 二、实验方法
  • 三、实验结果
  • 3.1 钩藤酸E诱导KB细胞死亡呈明显的时间和剂量依赖性
  • 3.2 内毒素并未参与钩藤酸E的细胞毒作用
  • 3.3 钩藤酸E诱导KB细胞凋亡的形态学变化
  • 3.4 钩藤酸E对KB细胞的电镜观察
  • 3.5 钩藤酸E诱导凋亡性的细胞死
  • 3.6 钩藤酸E诱导KB细胞死亡对细胞周期的影响
  • 3.7 PKC激酶对钩藤酸E诱导KB细胞死亡的影响
  • 3.8 钩藤酸E诱导KB凋亡经过caspase激活
  • 3.9 Bcl-2家族成员和细胞色素c对钩藤酸E诱导KB细胞凋亡的影响
  • 3.10 p53和ERK在钩藤酸E诱导KB细胞凋亡中的调节作用
  • 四、讨论
  • 第五章 桂皮酰基乌苏酸诱导人口腔上皮癌KB细胞凋亡机制研究
  • 一、实验材料
  • 二、实验方法
  • 三、实验结果
  • 3.1 桂皮酰基乌苏酸对肿瘤细胞的细胞毒活性
  • 3.2 桂皮酰基乌苏酸诱导KB细胞死亡呈明显的时间和剂量依赖性
  • 3.3 内毒素并未参与桂皮酰基乌苏酸的细胞毒作用
  • 3.4 桂皮酰基乌苏酸对小鼠骨髓细胞的影响
  • 3.5 桂皮酰基乌苏酸对小鼠脾淋巴细胞的影响
  • 3.7 桂皮酰基乌苏酸对人外周血单核细胞（PBMC）的影响
  • 3.8 桂皮酰基乌苏酸对耐药细胞株MCF-7的影响
  • 3.9 桂皮酰基乌苏酸诱导KB细胞凋亡的形态学变化
  • 3.10 桂皮酰基乌苏酸对KB细胞的电镜观察
  • 3.11 PKC激酶对桂皮酰基乌苏酸诱导KB细胞死亡的影响
  • 3.12 桂皮酰基乌苏酸诱导KB凋亡经过caspase激活
  • 3.13 Bcl-2家族成员和细胞色素c对桂皮酰基乌苏酸诱导KB细胞凋亡的影响
  • 3.14 p53在桂皮酰基乌苏酸诱导KB细胞凋亡中的调节作用及对细胞周期的影响
  • 3.15 MAPK家族成员参与ZCU诱导KB细胞凋亡
  • 四、讨论
  • 致谢
  • 附录

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