重组人αB-晶体蛋白对大鼠视神经损伤修复作用的研究

论文摘要

视神经损伤是一种视功能损伤严重,预后极差的眼外伤类型和致盲原因。因为中枢神经系统组织损伤后不能再生,和缺乏修复功能,目前尚无确切的治疗方式。我们的研究小组近十年的研究结果表明晶体损伤后释放的晶体蛋白对视神经损伤有修复和再生作用,这一现象为视神经损伤的治疗带来了希望。近年的国内外研究表明晶体蛋白中的αB-晶体蛋白是这一家族中最活跃的小分子蛋白,属于热休克蛋白家族,不仅可以对变性神经组织有保护和促进修复作用,还具有抑制炎症、应激反应,维护细胞骨架蛋白和骨架网络稳定性,及抵抗缺氧、高温、反射线及药物等因素诱导的细胞凋亡的作用。但由于αB-晶体蛋白不能从提取的天然α-晶体蛋白中分离出来,重组人αB-晶状体蛋白是开发应用的唯一途径。国外文献报道重组αB-晶体蛋白用于治疗多发性硬化动物实验取得了良好的疗效。而重组人αB-晶体蛋白全身应用,是否具有视神经保护作用未见文献报道。由此,探讨如何重组有高活性的人αB-晶体蛋白,明确重组人αB-晶体蛋白静脉应用,对视神经保护作用,并对全身重要器官和行为学是否有影响,可能为重组人aB-晶体蛋白临床应用奠定基础,为临床治疗视神经损伤提供新的途径。【目的】建立重组蛋白表达体系,重组人αB-晶体蛋白和有更强分子伴侣活性的Trx-αB-crystallin融合蛋白;通过建立大鼠视神经钳夹伤模型,进一步明确重组人αB-晶体蛋白对视神经损伤后视网膜神经节细胞的保护作用;在此基础上,通过动物模型电生理检查分析重组人αB-晶体蛋白和Trx-αB-crystallin融合蛋白治疗视神经损伤的疗效,并通过显微组织学检查明确静脉应用重组人αB-晶体蛋白和Trx-αB-crystallin融合蛋白对全身重要脏器的影响,为开发重组人αB-晶体蛋白药物治疗视网膜神经节细胞损伤和视神经损伤奠定实验基础。【方法】1、根据已知人αB-晶体蛋白基因序列构建目的基因,并建立目的基因载体质粒pET32a和pET28a,通过BL21大肠杆菌细胞为宿主的表达系统,IPTG诱导表达后纯化,得到高纯度的重组人αB-晶体蛋白和Trx-αB-crystallin融合蛋白,通过免疫印迹和蛋白质谱分析鉴定重组蛋白。并利用小分子热休克蛋白胰岛素活性实验,验证重组人αB-晶体蛋白和Trx-αB-crystallin融合蛋白的体外活性,同时,通过对比研究观察两者分子伴侣活性强弱。2、以成年Long Evans大鼠为研究对象,建立视神经钳夹损伤模型,静脉注射重组人αB-晶体蛋白、Trx-αB-crystallin融合蛋白、Trx蛋白和生理盐水。通过大脑上丘和外侧膝状体荧光金逆行标记和视网膜铺片的免疫组化染色方法,分别于损伤后2周和4周观察视网膜内存留有活性的视网膜神经节细胞,并定量分析和比较各组视网膜神经节细胞数量。3、以成年Long Evans大鼠建立视神经钳夹损伤模型,静脉注射重组人αB-晶体蛋白、Trx-αB-crystallin融合蛋白、Trx蛋白和生理盐水。利用闪光视觉诱发电位检测方法,于损伤后2、4周观察各组大鼠视功能情况,探讨重组人αB-晶体蛋白和Trx-αB-crystallin融合蛋白对视神经损伤后视功能修复的影响。4、利用行为学方法,观察上述各组实验动物于损伤后2、4周的行为学变化,并在4周时处死大鼠,取心、肝、脾、肾重要脏器行组织病理学检查,评估静脉应用重组人αB-晶体蛋白和Trx-αB-crystallin融合蛋白的安全性。【结果】1、构建的载体质粒pET32a-αB-crystallin和pET28a-αB-crystallin,通过BL21大肠杆菌细胞表达和纯化可以得到高纯度的重组人αB-晶体蛋白和Trx-αB-crystallin融合蛋白。2、重组人αB-晶体蛋白和Trx-αB-crystallin融合蛋白均具有分子伴侣活性,且Trx-αB-crystallin融合蛋白的活性大于重组人αB-晶体蛋白。3、视神经钳夹伤后荧光金逆行标记示,静脉注射重组人αB-晶体蛋白组和Trx-αB-crystallin融合蛋白组在损伤后2周和4周与对照组相比均有较多的具有轴浆运输功能的视网膜神经节细胞存活,统计学差异显著（P<0.05）。4、视网膜神经节细胞免疫组化荧光染色示,视神经钳夹伤后2周和4周静脉注射重组人αB-晶体蛋白和Trx-αB-crystallin融合蛋白组较Trx蛋白和生理盐水组有更多的视网膜神经节细胞存活,统计学差异显著（P<0.05）。5、视神经钳夹伤后2周脉注射重组人αB-晶体蛋白和Trx-αB-crystallin融合蛋白组大鼠较Trx蛋白和生理盐水组视功能检查（闪光视觉诱发电位）示P1波波幅较大,差异显著（P<0.05）。但4周时,各组间P1波波幅和潜时差异不显著。6、大鼠视神经钳夹伤后4周,重组人αB-晶体蛋白、Trx-αB-crystallin融合蛋白组大鼠、Trx蛋白和生理盐水组行为学检测无显著性差异,且各组重要脏器组织学检查未见明显异常。【结论】1、大肠杆菌表达体系可以成功表达有分子伴侣活性的重组人αB-晶体蛋白和Trx-αB-crystallin融合蛋白。2、重组人αB-晶体蛋白和Trx-αB-crystallin融合蛋白在视神经损伤后修复中发挥重要作用。通过静脉多次给药,可明显减少视神经损伤引起的视网膜节细胞死亡,保存更多有轴浆运输功能的视网膜神经节细胞,提示重组人αB-晶体蛋白和Trx-αB-crystallin融合蛋白有促进视神经损伤修复的作用,并可以在损伤早期有效保护视功能。3、全身静脉应用重组人αB-晶体蛋白和Trx-αB-crystallin融合蛋白安全,不会引起重要脏器病变和行为学改变。4、Trx-αB-crystallin融合蛋白中Trx标签可以增强αB-晶体蛋白的分子伴侣活性,但不能提高αB-晶体蛋白保护功能,提示αB-晶体蛋白的分子伴侣活性和保护细胞功能可能不完全是一个功能结构域。

论文目录

• 英文缩写一览表
• 英文摘要
• 中文摘要
• 前言
• 第一部分 人αB-晶体蛋白的重组及鉴定
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分 重组人αB-晶体蛋白和Trx-αB-crystallin融合蛋白静脉注射对大鼠视神经损伤后RGCs存活作用的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第三部分 重组人αB-晶体蛋白和Trx-αB-crystallin融合蛋白静脉注射的安全性研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 全文结论
• 致谢
• 参考文献
• 文献综述 αB-晶体蛋白的研究进展
• 参考文献
• 研究生期间发表论文及获课题资助