pESP15b/pARA-SP6表达载体的构建及应用研究

论文摘要

本研究旨在建立高效表达目的蛋白的原核表达载体系统pESP15b/pARA-SP6。在Novagen公司专利产品pET11a的基础上进行改造组建,即用SP6启动子替代T7启动子,并引入组氨酸标签（His tag）从而构建表达载体pESP15b。又以质粒pBlueScript（SK+）和pGro7为基础,构建另一个表达载体pARA-SP6。从而建立原核表达载体系统pESP15b/pARA-SP6。 为了使pESP15b/pARA-SP6表达载体能够最大限度地表达目的蛋白,以碱性磷酸酶（ShAP）为目的蛋白,对载体的宿主和培养温度进行了探讨。为了考察pESP15b/pARA-SP6表达系统的蛋白表达效果,以传统的原核表达载体pET28（a）System和最新上市的原核表达载体CSP System（pColdI载体）作为对照,以碱性磷酸酶（ShAP）为目的基因,对目的蛋白的表达量、可溶性目的蛋白的含量和蛋白活性等方面进行了比较。 通过SDS-PAGE、Western blotting、pNPP活性测定以及ImageMaser 1D Elite V3.01软件等分析结果表明,所构建的原核蛋白表达载体pESP15b/pARA-SP6,在蛋白酶缺陷型大肠杆菌BL21宿主中目的蛋白的表达量最高;在37℃、30℃和25℃条件下分别诱导表达,目的蛋白的表达量随温度的降低而明显增加,37℃培养条件下目的蛋白ShAP占蛋白表达总量的21.2%,而25℃时则达到32.5%;25℃培养条件下可溶性目的蛋白占蛋白总量的65.2%,为37℃时的2倍左右;目的蛋白的活性也随培养温度的降低而明显提高,37℃培养条件下为48.3U/g菌体,而25℃时为1117.6U/g菌体,活性提高约25倍。 作为对照的pET28（a）和pColdI蛋白表达体系,在最佳表达条件下,虽然目的蛋白的表达量与pESP15b/pARA-SP6表达体系无很大差异（分别为28.8%和32.85%）,但可溶性目的蛋白含量只占蛋白表达总量的30%左右,明显低于pESP15b/pARA-SP6蛋白表达系统。蛋白活性也明显低于新构建的pESP15b/pARA-SP6表达体系,分别为247.8U/g菌体和452U/g菌体,只是pESP15b/pARA-SP6载体系统的1/5和1/2。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 蛋白表达载体的研究状况
• 1.1.1 蛋白表达载体的分类
• 1.1.2 蛋白表达载体的构建要求
• 1.2 蛋白表达的特点
• 1.2.1 原核蛋白表达的特点
• 1.2.2 原核细胞中蛋白表达的过程
• 1.2.3 原核细胞表达蛋白的分类
• 1.3 提高蛋白表达效率的途径
• 1.3.1 提高蛋白表达量的方法
• 1.3.2 提高蛋白可溶性的方法
• 1.3.3 提高蛋白的稳定性的方法
• 1.3.4 降低蛋白毒性的方法
• 1.4 包涵体的形成原因及解决方法
• 1.4.1 包涵体概念和形成原因
• 1.4.2 解决包涵体的措施
• 1.5 蛋白表达的发展前景
• 参考文献
• 2.pESP15b/pARA-SP6表达载体系统的构建
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要试剂及生产厂家
• 2.1.2 主要仪器及生产厂家
• 2.1.3 引物
• 2.2 方法
• 2.2.1 pESP15b表达载体的构建
• 2.2.1.1 pESP11a载体构建（SP6 promoter替换T7 promoter）
• 2.2.1.2 pESP15b载体构建（His 标签的加入）
• 2.2.2 pARA-SP6表达载体的构建
• 2.3 结果分析
• 2.3.1 pESP15b/pARA-SP6表达载体的构建结果
• 2.3.1.1 pESP15b表达载体的构建结果
• 2.3.1.2 pARA-SP6表达载体的构建结果
• 2.4 小结
• 3.pESP15b/pARA-SP6表达载体的应用
• 3.1 重组质粒的构建
• 3.1.1 材料
• 3.1.1.1 主要试剂及生产厂家
• 3.1.1.2 主要仪器及生产厂家
• 3.1.1.3 引物
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 pESP15b-ShAP重组表达质粒的构建
• 3.1.2.2 pET28（a）-ShAP重组表达质粒的构建
• 3.1.2.3 pColdI-ShAP重组表达质粒的构建
• 3.1.3 结果分析
• 3.1.3.1 pESP15b-ShAP重组表达质粒的构建结果
• 3.1.3.2 pET28（a）-ShAP重组表达质粒的构建结果
• 3.1.3.3 pColdI-ShAP重组表达质粒的构建结果
• 3.1.4 小结
• 3.2 重组质粒的表达
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 方法
• 3.2.2.1 ShAP基因在pESP15b/pARA-SP6载体系统中的表达
• 3.2.2.2 ShAP基因在pET28（a）载体系统中的表达
• 3.2.2.3 ShAP基因在pColdI载体系统中的表达
• 3.2.3 结果分析
• 3.2.3.1 ShAP在pESP15b/pARA-SP6系统中的蛋白表达结果
• 3.2.3.2 ShAP在pET28（a）系统中的蛋白表达结果
• 3.2.3.3 pColdI载体系统中ShAP蛋白表达结果
• 3.2.4 讨论
• 3.2.5 小结
• 参考文献
• 4.结论与展望
• 4.1 主要结论
• 4.2 展望
• 5.创新点
• 6.发表论文情况
• 7.附录
• 致谢