Aspergillus tamarii FS132脂肪酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

论文摘要

本研究从新疆火焰山土样中分离到一株脂肪酶产生菌FS132，对其进行18SrRNA分子标记鉴定，进一步克隆了该菌脂肪酶基因（ATL），并实现了该脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达，为深入研究Aspergillus tamarii脂肪酶合成的分子机理奠定了基础，也为改造现有脂肪酶提供新的脂肪酶基因资源。主要研究内容及成果如下：（1）从新疆火焰山口土样中分离的一株脂肪酶产生菌FS132，菌落形态表明为霉菌。克隆测定了该菌18S rRNA基因序列，并将该序列进行比对和聚类分析，构建系统进化树。结果表明该菌与报道的Aspergillus tamarii具有最紧密亲缘关系。（2）ATL基因及其cDNA的克隆和序列分析：分别提取Aspergillus tamarii FS132基因组DNA和总RNA，根据资料，利用Aspergillus tamarii亲源关系较近的脂肪酶基因序列设计引物，采用PCR、RT-PCR等技术扩增了FS132脂肪酶基因（ATL）和全长cDNA序列。ATL-cDNA全长由921个碱基组成；PCR扩增获得的ATL-DNA由1742个碱基组成，包括ATL编码区，3’非翻译区和5’非翻译区基因的序列，其中ATL编码区有1024个碱基，含有2个内含子，大小分别为51 bp、52 bp。（3）为了验证所克隆到的ATL-cDNA序列的功能，构建重组表达载体，以毕赤酵母GS115为宿主进行功能表达分析。表达菌株经0.5％甲醇诱导培养，实现了Aspergillus tamarii FS132脂肪酶蛋白的分泌表达。经SDS-PAGE分析结果表明，重组酵母分泌36.7 kD左右的重组蛋白；三丁酸甘油酯检验板中出现水解圈：NaOH滴定法测定表明发酵液脂肪酶活力为20U／mL。（4）初步优化了Aspergillus tamarii FS132发酵产酶条件，产酶最适培养时间为45 h，培养基最适初始pH 7.0，最适培养温度36℃，最适摇瓶空气量25 mL／250 mL锥形瓶。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 中文文摘
• 目录
• 第1章 绪论
• 1.1 微生物脂肪酶简介
• 1.2 微生物脂肪酶的分子生物学研究进展
• 1.2.1 细菌脂肪酶分子生物学研究概况
• 1.2.2 真菌脂肪酶分子生物学研究概况
• 1.2.3 微生物脂肪酶分子改造研究进展
• 1.3 本课题研究的目的和意义
• 1.3.1 目的
• 1.3.2 意义
• 第2章 脂肪酶产生菌Aspergillus sp.FS132 18S rRNA基因序列分析
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.1.1 菌种
• 2.2.1.2 培养基及缓冲液
• 2.2.1.3 试剂与载体
• 2.2.1.4 寡聚核苷酸引物
• 2.2.2 方法
• 2.2.2.1 菌丝体总DNA的提取
• 2.2.2.2 感受态Ecoli.JM109制备
• 2.2.2.3 Aspergillus sp.FS132 18S rRNA基因的获得
• 2.2.2.4 目的基因的连接
• 2.2.2.5 转化
• 2.2.2.6 阳性克隆子筛选
• 2.2.2.7 SDS碱裂解法抽提质粒
• 2.2.2.8 测序
• 2.2.2.9 18S rRNA序列分析和进化树构建
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 Aspergillus sp.FS132形态学观察
• 2.3.2 Aspergillus sp.FS132 18S rRNA基因的获得
• 2.3.3 阳性克隆子的筛选与验证
• 2.3.4 18S rRNA基因序列及系统进化树分析
• 2.4 小结
• 第3章 Aspergillus tamarii FS132脂肪酶基因组DNA（ATL-DNA）及cDNA（ATL-DNA）序列分析
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.1.1 菌种
• 3.2.1.2 载体及工具酶
• 3.2.1.3 主要试剂
• 3.2.1.4 主要仪器设备
• 3.2.1.5 寡聚核苷酸引物
• 3.2.2 方法
• 3.2.2.1 Aspergillus tamarii FS132部分脂肪酶基因组DNA的获得
• 3.2.2.2 Aspergillus tamarii FS132脂肪酶基因组DNA（ATL-DNA）的获得
• 3.2.2.3 Aspergillus tamarii FS132脂肪酶基因组DNA的克隆及序列测定
• 3.2.2.4 Aspergillus tamarii FS132脂肪酶cDNA（ATL-cDNA）获得
• 3.2.2.5 Aspergillus tamarii FS132脂肪酶cDNA克隆及序列测定
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 Aspergillus tamarii FS132部分脂肪酶基因的获得
• 3.3.2 Aspergillus tamarii FS132脂肪酶基因组DNA（ATL-DNA）的获得
• 3.3.3 阳性克隆子的筛选与验证
• 3.3.4 ATL-DNA测序结果
• 3.3.5 Aspergillus tamarii FS132脂肪酶cDNA克隆及序列测定
• 3.3.5.1 菌丝体总RNA的提取
• 3.3.5.2 RT-PCR
• 3.3.5.3 阳性克隆子菌落PCR验证
• 3.3.5.4 ATL-cDNA测序结果
• 3.3.5.5 ATL-DNA与ATL-cDNA序列比对分析
• 3.4 小结
• 第4章 Aspergillus tamarii FS132脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.1.1 载体与宿主菌
• 4.2.1.2 工具酶
• 4.2.1.3 寡聚核苷酸引物
• 4.2.1.4 Aspergillus tamarii FS132脂肪酶基因表达实验所用的溶液及培养基
• 4.2.2 方法
• 4.2.2.1 重组表达质粒的构建
• 4.2.2.2 pPIC 3.5K/ATL-cDNA重组质粒的线性化
• 4.2.2.3 制备感受态甲醇毕赤酵母GS115
• 4.2.2.4 重组质粒电击转化至感受态毕赤酵母
• 4.2.2.5 重组酵母的筛选、鉴定及PCR验证
• 4.2.2.6 酵母重组细胞的诱导表达
• 4.2.2.7 表达产物的鉴定
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 pMD19-T/ATL-cDNA重组质粒、pBluescript ks（+）质粒的酶切
• 4.3.2 PKS/ATL-cDNA重组质粒、pPIC 3.5K表达质粒的酶切
• 4.3.3 重组质粒电转化至感受态毕赤酵母细胞
• 4.3.4 重组酵母菌的平板筛选验证及PCR验证
• 4.3.5 表达蛋白的活性检测
• 4.3.5.1 三丁酸甘油脂验证板法检测酶活
• 4.3.5.2 NaOH滴定法检测酶活
• 4.3.5.3 SDS-PAGE检测重组蛋白的表达
• 4.4 小结
• 第5章 Aspergillus tamarii FS132产酶条件的初步优化
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.1.1 菌种
• 5.1.1.2 发酵培养基
• 5.1.2 方法
• 5.1.2.1 培养基初始pH对FS132产酶的影响
• 5.1.2.2 空气量和培养温度试验
• 5.1.2.3 发酵周期试验
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 培养基初始pH对FS132产酶的影响
• 5.2.2 空气量和培养温度试验
• 5.2.3 发酵周期试验
• 5.3 小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
• 致谢
• 个人简历