光滑球拟酵母中糖酵解效率与丙酮酸合成的调控研究

论文摘要

本文以一株能在胞外大量积累丙酮酸的光滑球拟酵母（Torulopsis glabrata）四重维生素（硫胺素、生物素、吡哆醇和烟酸）的营养缺陷型菌株CCTCC M202019为研究菌株。以丙酮酸高效生产为目标,在充分了解光滑球拟酵母中能量和碳代谢途径的基础上利用生物化学和菌种选育的理论和方法,就调控糖酵解效率和丙酮酸合成的关键因素及其作用机理开展研究。主要研究结果如下:1.利用氧化磷酸化抑制剂（鱼藤酮、抗霉素A和寡霉素）和菌种诱变从内外源两个方面研究降低胞内能荷水平对酵解途径的影响及调控机理。添加外源抑制剂显著降低了胞内ATP水平,提高了糖酵解关键酶磷酸果糖激酶（PFK）活性,进而提高T. glabrata葡萄糖消耗速度和丙酮酸生产速度。改变胞内ATP水平并不影响糖酵解途径其他关键酶己糖激酶（HK）、丙酮酸激酶（PK）活性。在氧化磷酸化途径中,F0F1-ATPase在ATP合成中起着关键性的作用。利用菌种选育技术获得F0F1-ATPase活性降低65%的突变株N07。添加F0F1-ATPase抑制剂双环己基碳二亚胺（DCCD）、叠氮钠（NaN3）、新霉素并不降低突变株N07的F0F1-ATPase活性。F0F1-ATPase活性的降低提高了底物水平磷酸化途径（酵解途径）关键酶的活性。与出发菌株比较,N07菌的葡萄糖消耗速度和丙酮酸生产速度分别提高了34%和42.9%,发酵周期缩短12 h;2.综合外源抑制剂和内源突变对T. glabrata能量代谢和酵解的影响,发现:降低胞内ATP含量能显著提高PFK活性（R2=0.9971）和葡萄糖消耗速度（R2=0.9967）以及丙酮酸生产速度（R2=0.965）,葡萄糖消耗速度的增加是糖酵解途径中关键酶PFK活性（R2=0.9958）和PK活性（R2=0.8706）增加所导致的。这一结果从能量代谢流、碳代谢流和关键酶活性等三方面揭示了真核微生物细胞中氧化磷酸化途径与中心代谢途径（酵解）的定量关系;3利用高溶氧条件下阻断电子传递链和低溶氧下提高乙醇脱氢酶活性的方法,研究改变T. glabrata中NADH氧化途径对能量代谢和酵解途径的影响。在摇瓶中增加培养基中NAD+前体物质--烟酸（NA）的浓度促进了葡萄糖消耗速度（2.01 g/（L h））和丙酮酸产量（46.4 g/L）的提高。T. glabrata CCTCC M 202019经溴化乙锭（EtBr）处理后获得F0F1-ATPase、复合体I、复合体I+III、复合体II+III、复合体IV活性下降22.2%、41.6%、53.1%、23.6%和84.7%的呼吸缺陷型突变株RD-18,在细胞生长对数期流加2.1 mmol/L外源电子受体乙醛使呼吸缺陷型突变株RD-18单位细胞消耗葡萄糖和生产丙酮酸的能力分别提高了15.4%

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 概述
• 1.2 国内外研究进展
• 1.2.1 葡萄糖转运和磷酸化对酵解的调控
• 1.2.2 糖酵解关键酶对酵解的调控
• 1.2.3 能量代谢对酵解途径的调控
• 1.2.4 胞内NADH 再生对酵解途径的调控
• 1.2.5 产物抑制对提高目标代谢产物产量的影响
• 1.3 本研究的主要内容
• 1.3.1 Torulopsis glabrata 发酵生产丙酮酸存在的问题
• 1.3.2 本论文的主要研究内容
• 1.3.3 论文撰写说明
• 参考文献
• 第二章 抑制光滑球拟酵母氧化磷酸化途径提高酵解速度
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.3 结果
• 2.3.1 外源抑制剂降低电子传递链对T. glabrata 能量代谢和酵解的影响
• 2.3.2 F0F1-ATPase活性降低突变株的获得
• 2.3.3 降低F0F1-ATPase活性对T. glabrata能量代谢和酵解的影响
• 2.3.4 ATP 水平对糖酵解途径的影响
• 2.4 讨论
• 2.4.1 氧化磷酸化抑制剂对胞内ATP 水平和糖酵解流量的影响
• 2.4.2 调节ATP 合成途径对糖解途径的影响
• 2.4.3 胞内ATP 水平与糖酵解途径关键酶关系
• 2.5 小结
• 参考文献
• 第三章 改变NADH 氧化途径加速葡萄糖消耗
• 3.1 前言
• 3.2 材料和方法
• 3.3 结果
• 3.3.1 烟酸对糖酵解速度的影响
• 3.3.2 改变NADH 氧化途径加速葡萄糖消耗
• 3.3.3 低溶氧下提高ADH 活性加速葡萄糖消耗
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 参考文献
• 第四章 低能荷水平下加强葡萄糖磷酸化提高糖酵解速度
• 4.1 前言
• 4.2 材料和方法
• 4.3 结果
• 4.3.1 己糖激酶抑制剂对葡萄糖磷酸化及酵解的影响
• 4.3.2 镁离子加强光滑球拟酵母葡萄糖磷酸化
• 4.3.3 己糖激酶活性提高菌株的选育
• 4.3.4 2-脱氧葡萄糖浓度对细胞生长的影响
• 4.3.5 突变株DGR09、DN11 与菌株CCTCC M202019、N07 葡萄糖代谢比较
• 4.3.6 不同菌株在生长状态和休止状态下葡萄糖消耗速度的比较
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 参考文献
• 第五章 提高光滑球拟酵母耐受氯化钠能力加强丙酮酸生产
• 5.1 前言
• 5.2 材料和方法
• 5.3 结果
• 5.3.1 氯化钠、山梨醇浓度对T. glabrata 生长及发酵生产丙酮酸的影响
• 5.3.2 连续培养筛选耐高渗突变株
• 5.3.3 氯化钠浓度对突变株与出发菌株的影响
• 5.3.4 高葡萄糖浓度对突变株与出发菌株发酵生产丙酮酸的比较
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 参考文献
• 第六章 利用基因组重排技术提高丙酮酸产量和生产强度
• 6.1 前言
• 6.2 材料和方法
• 6.3 结果
• 6.3.1 原生质体制备与融合条件的选择
• 6.3.2 基因组改组（Genome shuffling）
• 6.3.3 F3-28 发酵生产丙酮酸的过程曲线
• 6.4 结论
• 参考文献
• 结论
• 论文创新点
• 与博士学位相关的期刊论文
• 致 谢