c-Abl酷氨酸激酶参与基因转录调控的分子机制的研究

论文题目: c-Abl酷氨酸激酶参与基因转录调控的分子机制的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 细胞生物学

作者: 荆玉起

导师: 郝水,曾宪录

关键词: 基因转录调控,聚合酶

文献来源: 东北师范大学

发表年度: 2005

论文摘要: 真核基因转录的调控是当前细胞分子生物学的前沿研究领域,现有的研究表明,许多重要生命现象的深层次问题都集结于此。真核基因转录的调控是一个十分复杂而又协调有序的过程,不仅需要染色体结构的改变,而且还有众多蛋白质分子的参与。c-Abl非受体酪氨酸激酶就是其中之一。c-Abl基因编码145kDa的非受体酪氨酸激酶,它广泛存在于真核细胞中,目前关于c-Abl参与基因转录调控活动的机制还不很清楚。广泛存在于细胞中的c-Abl对于细胞功能十分重要,c-Abl调控真核基因转录的研究无疑对理解细胞生命活动和疾病发生机理意义重大。 本文通过瞬时转染、荧光素双报告系统检测、RT-PCR及Realtime PCR等实验结果证实,c-Abl促进内源和外源的c-fos和p21基因的转录。我们发现c-Abl促进c-fos的基因转录依赖于c-Abl的酪氨酸激酶活性和核定位功能。我们利用过表达c-Abl和蛋白质免疫沉淀实验发现,在293T细胞中c-Abl和RNA聚合酶II(RNAPII)的大亚基共沉淀,并且过表达c-Abl能够增加RNAP II大亚基的酪氨酸磷酸化程度。表达RNAP II的大亚基CTD表达质粒,发现CTD能够抑制c-Abl促进c-fos的转录活性。染色体免疫沉淀实验结果表明,在体内c-Abl和RNAP II能被募集到c-fos启动子的(-74-+185)区域。总之,c-Abl能够通过磷酸化RNAP II促进c-fos基因转录。本文首次报道了c-Abl对RNAP II大亚基的磷酸化能够促进c-fos基因的转录,并揭示了CTD的酪氨酸磷酸化在RNAP II介导的基因转录中所发挥的重要作用。 另外,我们利用瞬时转染 293T、荧光素酶双报告检测及染色体免疫沉淀等方法研究了 c-Abl 是否参与了 p21 基因转录调控活动,发现 c-Abl 能够协同 p53促进 p21 基因的转录,这种协同作用还依赖于 p53 的完整构象和结构,在细胞内c-Abl 能够被募集到包含 p53 结合位点的 p21 启动子区域上。我们转染 K562 细胞,荧光素酶双报告检测结果表明,c-Abl促进p21基因的转录可以不依赖于p53,可能通过活化 STAT5 调控 p21 基因转录。本文确认了一种受 c-Abl 调控的下游靶基因 p21,并且探讨了 p53 和 STAT5 在参与 c-Abl 调控 p21 基因转录中的重要作用,为进一步深入研究 c-Abl 参与基因转录调控活动的机制奠定了基础。

论文目录:

目录

英文缩写词

摘要

第一部分 前言

一、染色质结构与基因活化

1. 核小体结构的动态调整

2. 核心组蛋白的可逆乙酰化与基因转录

3.D NA 甲基化与染色质中基因转录的阻遏

二、真核生物基因的转录调控

1. 顺式作用元件

2. 反式作用因子

三、c-Abl 概述

1.c -Abl 的基本结构

2.c -Abl 的亚细胞定位

四、c-Abl 活性调节

五、c-Abl 生理功能

1.c -Abl 与细胞凋亡

2.c -Abl 与细胞周期调控

3.c -Abl 与白血病

4.c -Abl 与基因转录调控

六、本论文的研究内容和意义

第二部分 实验材料与方法

一、实验材料

1. 细胞

2. 抗体

3. 试剂

4. 质粒

5. 引物

6. 主要仪器及设备

二、实验方法

1. 细胞培养

2. 质粒的大量制备

3. 瞬时电转染方法

4. 荧光素酶双报告检测

5. RT-PCR，RealTime PCR

6. 细胞质和细胞核提取物的制备

7. 蛋白质电泳和免疫印迹

8. 蛋白质免疫沉淀

9. 染色体免疫沉淀

第三部分 实验结果与分析

一、c-Abl 通过磷酸化RNAP II 促进c-fos 基因转录

1.c -Abl 促进外源c-fos 的基因转录

2.c -Abl 促进c-fos 的基因转录依赖于c-A的酪氨酸激酶活性及核定位功能

3.c -Abl 和RNAP II 大亚基共沉淀，并且能增加RNAP II 大亚基磷酸化

4. 表达RNAP II 的大亚基CTD 表达质粒抑制c-Abl 促进外源c-fos 的转录活性

5.c -Abl 和RNAP II 能够被募集到c-fos 启动子区域

6.c -Abl 不能促进外源IL-8，p15，p16 基因的转录

7.C B 处理未影响c-Abl 对c-fos 基因转录的促进作用

二、c-Abl 协同p53 和STAT5 促进p21 基因的转录

1.c -Abl 促进p21 基因的转录

2.c -Abl 协同p53 促进p21 基因的转录

3.c -Abl 可能还通过STAT5 调节p21 的转录

第四部分 讨论

一、c-Abl 参与c-fos 基因转录调控

二、c-Abl 通过磷酸化RNAP II 大亚基促进c-fos 基因转录

三、c-Abl 调控p21 基因转录的机制

第五部分 结论和主要创新点

参考文献

作者简介

致谢

发布时间: 2005-07-07

参考文献

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