具有PPARα/γ双重激动作用的抗糖尿病药物的生物学筛选

论文题目: 具有PPARα/γ双重激动作用的抗糖尿病药物的生物学筛选

论文类型: 博士论文

论文专业: 药理学

作者: 徐成

导师: 曹颖林,李松,王莉莉

关键词: 双重激动剂,化合物筛选,胰岛素抵抗,型糖尿病,肥胖,脂代谢紊乱

文献来源: 沈阳药科大学

发表年度: 2005

论文摘要: 肥胖及其所诱发的2型糖尿病已成为危害人类的重要疾病。许多资料表明，肥胖与2型糖尿病共同存在，并且关系十分复杂。2型糖尿病中超过85％的人表现为肥胖，同时肥胖又是诱导2型糖尿病发生的重要危险因素。肥胖患者常常伴随着脂代谢紊乱，这将导致机体对胰岛素敏感性的降低，最终可诱发2型糖尿病的发生。同时2型糖尿病患者也伴随高血脂血症。因此，调节脂代谢紊乱、改善胰岛素抵抗是预防和治疗2型糖尿病的新方向。过氧化物增生活性受体（PPARs）是配体激活转录因子，属于核受体超家族成员。它可以同时调控多种基因表达，参与了葡萄糖和脂代谢调节等重要的生理过程。不同的PPAR亚型有不同的组织分布和生理功能。PPARa主要分布在肝脏组织中，其主要作用是调节脂代谢。PPARγ主要分布在脂肪组织和骨骼肌中，其主要作用是增加组织对胰岛素的敏感性，调节葡萄糖的代谢。因此，以PPARs为药物靶标，发现和优化PPARa／γ双重激动剂将为肥胖和2型糖尿病的预防和治疗提供有效的药物。本文通过体内和体外多种筛选平台，对新合成的85个化合物进行PPARa和PPARγ双重激动作用的筛选。并在PPAR转录调控水平，对所筛选出化合物的降糖降脂机制进行了初步探讨。首先，应用PCR和DNA的克隆技术构建了pM-hPPARa、pM-hPPARγ和pB4-RES-tk-luc质粒，组成了萤火虫荧光素酶单报告基因的筛选平台。并运用瞬时转染的方法，将pM-hPPARa或pM-hPPARγ和pB4-RFS-tk-luc质粒转染到HEK-293细胞中，通过检测荧光素酶的活力，对85个新化合物进行PPARa和PPARγ双重激动作用的初步筛选。结果表明，18个化合物有较好的PPARa／γ的双重激动作用。然后，基于PPARa功能的降脂作用和基于PPARγ功能的促前脂肪细胞分化作用，在功能水平对18个化合物的PPARa／γ双重激动作用进行了第二次筛选。结果表明，有10个化合物能够明显的降低急性高脂小鼠的血脂水平，同时能够促进前脂肪（3T3-L1）细胞分化并有较好的量效关系。通过萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶所组成的双报告基因筛选平台，评价了10个化合物对PPARa和PPARγ激动作用的EC50．结果表明有7个化合物具有较强的PPARa／γ双重激动作用，它们对PPARa的激动作用强于罗格列酮（阳性对照药物），对PPARγ的激动作用相当于罗格列酮。通过人正常胚肺细胞（HLF）细胞生长抑制试验、大鼠胚胎中脑微团致畸试验和小鼠的急性毒性试验，对7个化合物的体内外毒性进行初步评价，结果表明，有1个化合物有较强的细胞毒性和潜在的致畸作用，其它6个化合物的体内和体外毒性较小。为了明确化合物的降糖降脂效果，通过正常小鼠的糖耐量试验以及2型糖尿病小鼠模型的降糖降脂试验，对化合物进行了整体动物的药效水平筛选。在糖耐量试验中，化合物对正常小鼠的血糖和糖耐量没有影响，表明化合物的作用靶点不是胰岛B细胞。在2型糖尿病小鼠的降糖降脂试验中，化合物10mg／kg剂量时，能够明显降低血中的葡萄糖、游离脂肪酸（FFA）、甘油三脂（TG）和总胆固醇（T-CHO）的浓度，升高高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的水平。同时化合物在3mg／kg剂量时，也表现出对葡萄糖、TG和FFA较好的调控作用，表明化合物在高剂量时对2型糖尿病有较好的治疗作用。在低剂量时，化合物能够通过改善脂代谢紊乱，达到预防胰岛素抵抗及2型糖尿病的作用。最后，通过RT-PCR和western印迹法对PPARa和PPARγ的组织分布进行研究。结果表明，PPARa主要表达在人的肝脏细胞和小鼠的肝脏组织中，而PPARγ在人的肝脏细胞、小鼠的脂肪细胞和骨骼肌细胞以及肝脏组织、脂肪组织和骨骼肌中均有表达。RT-PCR进一步研究表明，化合物能够通过激活PPARa和PPARγ，增加肝脏组织中脂蛋白酯酶（LPL）、乙酰辅酶A氧化酶（ACO）；脂肪组织中特异的脂肪酸转运蛋白（aP2）、葡萄糖转运体4（GluT4）和LPL以及骨骼肌中GluT4的基因表达，表明化合物能够通过调节糖脂代谢的相关基因达到降糖调脂作用。总之，我们通过体内外的多种筛选方法，筛选出6个具有PPARa／γ双重激动作用的化合物。这些化合物不仅能够调节糖脂代谢，而且可以促进前脂肪细胞的分化，改善胰岛素抵抗。结果表明，这些化合物有希望成为肥胖、高血脂症和2型糖尿病的新的预防和治疗药物。

论文目录:

中文摘要

英文摘要

缩略语说明

第一章绪论

一肥胖与2型糖尿病

二临床治疗糖尿病的药物

1 磺脲类降糖药

2 双胍类降糖药物

3 a-葡萄糖苷酶抑制剂

4 噻唑烷二酮类

三 PPAR

1 PPAR的结构与功能

2 PPAR的配体

3 PPAR与脂代谢

4 PPAR与胰岛素抵抗

3 PPAR双重激动剂

参考文献

第二章萤火虫荧光素酶报告基因筛选平台的建立

一实验部分

1 实验材料

2 实验方法

二实验结果

1 pB4-RES-tk-luc质粒图

2 PPAR α／γ双重激动剂的筛选平台

三讨论与结论

参考文献

第三章化合物的初步筛选

一实验部分

1 实验材料

2 实验方法

二实验结果

1 对C系列13个化合物的筛选

2 对O系列12个化合物的筛选

3 对L系列23个化合物的筛选

4 对E系列19个化合物的筛选

5 对S系列6个化合物、P系列5个化合物、G系列3个化合物和B系列4个化合物的筛选

三讨论与结论

第四章化合物的二次筛选

一实验部分

1 实验材料

2 实验方法

二实验结果

1 化合物对急性高脂模型小鼠的降脂作用

2 化合物促前脂肪细胞(3T3-L1)分化作用

3 化合物EC_(50)

4 化合物促3T3-L1细胞分化的量效关系

三讨论与结论

参考文献

第五章化合物毒性实验

一实验部分

1 实验材料

2 实验方法

二实验结果

1 化合物对HLF细胞生长抑制的影响(MTT法)

2 化合物的致畸作用(中脑微团试验)

3 化合物的急性毒性试验(上下法)

三讨论与结论

参考文献

第六章化合物的药效作用筛选

一实验部分

1 实验材料

2 实验方法

二实验结果

1 化合物对正常小鼠糖耐量的影响

2 化合物对高脂饲料腹腔注射链脲佐菌素致2型糖尿病小鼠血糖和血脂的影响

3 化合物对db／db小鼠血糖和血脂的影响

三讨论与结论

参考文献

第七章化合物作用机制研究

一实验部分

1 实验材料

2 实验方法

二实验结果

1 不同细胞组织中PPAR α、γ mRNA的表达

2 不同细胞组织中PPAR α、γ蛋白的表达

3 化合物对LO2细胞中ACO mRNA表达的影响

4 化合物对3T3-L1细胞中aP2、LPL、和GluT4 mRNA表达的影响

5 化合物对C2C12细胞中GluT4 mRNA表达的影响

6 化合物对db／db小鼠肝脏中LPL mRNA表达的影响

7 化合物对db／db小鼠脂肪组织中aP2、LPL、和GluT4 mRNA表达的影响

8 化合物对db／db小鼠骨骼肌中GluT4 mRNA表达的影响

三讨论与结论

参考文献

总结

致谢

附录

发布时间: 2006-12-14

参考文献

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[3].PPAR α/γ双激动剂西格列羧对胰岛素抵抗和脂质紊乱的改善作用及其作用机制研究[D]. 李平平.中国协和医科大学2006
[4].阿托伐他汀在血管内皮保护中的作用及机制的探讨[D]. 路岩.大连医科大学2007
[5].一、PPARγ激动剂罗格列酮及GLP02的抗肿瘤作用及机制研究二、hPPARγ2质粒的构建和高表达细胞模型的建立及生物学功能探讨三、hPPARγ2单克隆抗体的制备[D]. 李燕.中国协和医科大学2006
[6].高静水压刺激对血小板活化的影响及PPARγ的保护作用的研究[D]. 王伶.南昌大学2008
[7].替米沙坦对骨骼肌糖代谢的影响及机制研究[D]. 冯晓丽.第三军医大学2009
[8].黄酮类化合物库内小分子4a经由PPAR-β-Mfn2-[Ca2+]M信号调控胚胎干细胞神经分化[D]. 梅宇钦.浙江大学2013
[9].SLCO1B1基因多态性对瑞格列奈药动学的影响以及PPAR-γ2和PTPRD基因多态性对吡格列酮疗效的影响[D]. 裴奇.中南大学2012
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