非小细胞肺癌SP细胞亚群（干细胞相关亚群）分离鉴定及相关功能研究

论文摘要

肺癌是当今世界上对人类健康与生命危害最大的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率呈逐年上升趋势。尽管在过去的20多年中,肺癌在诊断、手术和放、化疗等方面取得了一定进展,多学科综合治疗也已达成共识,但治疗效果并不乐观,总的5年生存率低于15%。探明肺癌发生、发展的分子机制,寻找有效治疗肺癌的新的靶点,是亟待解决的难题和挑战。近年来,越多的研究证据表明肿瘤细胞中的某些亚群具有自我更新和分化潜能,尽管所占比例极少,但却很可能是肿瘤的发生、生长、耐药以及转移、复发的根源。这些细胞由于具有干细胞的特征而被称为肿瘤干细胞。肿瘤干细胞理论认为肿瘤组织一般由三种细胞成分构成:①具有无限增殖能力和形成新的肿瘤克隆的肿瘤细胞,又称肿瘤干细胞;②具有有限增殖能力但不能形成新的肿瘤克隆的肿瘤细胞;③上述两种能力都丧失的肿瘤细胞。许多治疗方法虽然可使肿瘤体积明显缩小,有的甚至可达到完全缓解,但实际上大部分肿瘤经过一段时间的缓解期之后又会复发或转移,这可能是由于现有的治疗手段没有清除这些决定复发和转移的关键细胞——肿瘤干细胞的缘故。肿瘤干细胞的研究已成为肿瘤研究领域中的热点,尽管仍处于探索阶段,但也取得了一些进展,为人类最终攻克恶性肿瘤带来了新的希望。本研究的目的在于探讨一种简单分离鉴定肺癌干细胞的方法,为更好的支持癌干细胞理论,发现更多的肿瘤干细胞提供经验,为初步阐明肺癌SP细胞亚群（干细胞相关亚群）的生物学行为特征,进一步探索其分子学特征,并为进一步对肺癌的预后监测、靶向治疗的研究提供新的理论依据。肺癌组织中ABCG2的表达及其临床价值目的:探讨干细胞侯选基因ABCG2基因在非小细胞肺癌组织中的表达及其临床意义。方法:用RT-PCR方法检测8例正常肺组织和48例非小细胞肺癌术后标本中ABCG2基因的表达情况,并分析其与临床病理特征的关系和对预后的影响。结果:ABCG2基因在8例正常肺组织中全部呈阳性表达,48例肺癌组织中22例呈阳性表达,表达率为45.8%（22/48）,二者差别有显著意义（P＜0.05）;ABCG2的表达在非小细胞肺癌各种临床病理特征中的比较差别无显著意义（P＞0.05）;ABCG2（+）组生存期短于ABCG2（-）组（P＜0.05）;ABCG2（+）组生存期有短于全组的趋势,ABCG2（-）组有长于全组的趋势,但差异没有统计学意义（P＞0.05）。结论:ABCG2的表达与非小细胞肺癌临床病理特征无关;ABCG2的表达情况是影响患者术后生存期的独立因子,阳性表达者预后较差。A549细胞系SP细胞亚群的分离鉴定目的:探讨一种简单有效的分离鉴定肺癌干细胞的方法。方法:用免疫组化方法检测人肺腺癌A549细胞系中CD34和ABCG2蛋白的表达情况,以及15例肺癌组织中CD34蛋白的表达情况;用免疫磁珠方法以及流式细胞术方法分选A549细胞系中SP及非SP细胞亚群,并对该两亚群细胞的分化功能进行检测;用RT-PCR方法检测两亚群细胞ABCG2的表达。结果:免疫组化方法检测A549细胞系以及15例肺癌组织,结果CD34蛋白均呈阴性表达,A549细胞系中可以检测到ABCG2蛋白阳性表达,阳性细胞数约占2%。用免疫磁珠方法难以分选到SP及非SP细胞亚群。流式方法成功分选得到SP及非SP细胞亚群,其中SP细胞含量约为A549活细胞总量的1.09%,经Verapamil处理后下降为0.20%,两亚群细胞经培养后从新上机检测,发现SP细胞亚群可产生SP及非SP两种细胞,而非SP细胞只能产生非SP细胞。SP细胞表达ABCG2,非SP细胞则不表达。结论:流式细胞术是分选SP细胞的有效方法,A549细胞系SP细胞亚群可能富集了肿瘤干细胞。A549细胞系SP细胞亚群生物学特性的体外实验研究目的:探讨A549细胞系SP细胞亚群体外培养的生物学行为特征和侵袭转移机制。方法:分别培养SP和非SP细胞亚群并绘制生长曲线,测定细胞分裂指数和细胞周期各时相分布并计算细胞增殖指数,比较两亚群细胞的增殖能力;平板克隆形成试验比较两亚群细胞的体外克隆形成能力;迁移和侵袭实验了解两亚群细胞的迁移、侵袭能力;G显带方法比较分析两亚群细胞的染色体核型。结果:两亚群细胞的生长曲线、细胞分裂指数、细胞周期时相分布以及细胞增殖指数无明显差别（P＞0.05）,表明两亚群细胞的增殖速度相似;平板克隆形成试验显示SP细胞的克隆形成率大于非SP细胞（P＜0.05）;侵袭试验示SP细胞亚群穿膜细胞数大于非SP细胞亚群（P＜0.05）,迁移试验则显示两亚群细胞穿膜细胞数无明显区别（P＞0.05）;染色体核型分析显示两亚群细胞染色体分裂相无明显区别。结论:A549细胞系SP细胞亚群体外成瘤能力及侵袭能力强于非SP细胞亚群。A549细胞系SP细胞亚群生物学特性的体内实验研究目的:探讨A549细胞系SP细胞亚群在体内的生物学特性。方法:制备SP和非SP细胞的单细胞悬液,设定不同数量级别,分别接种于裸鼠两侧腋窝皮下,观察两亚群细胞的成瘤情况;HE染色验证移植瘤病理组织类型;分别使用RT-PCR及免疫组化方法检测移植瘤中ABCG2表达情况。结果:SP亚群1×105数量级5个接种部位全部在接种3-5周后出现瘤块,1×104数量级5个接种部位中有3个分别在接种7-8周后出现瘤块,而非SP细胞亚群在本实验中接种的所有数量级（包括1×106及以下数量级）均未出现瘤块。经统计学处理,表明SP细胞的体内成瘤能力显著高于非SP细胞（P＜0.05）;移植瘤组织经石蜡包埋切片,行HE染色检查证实为腺癌;RT-PCR及免疫组化方法检测移植瘤,均观察到ABCG2呈阳性表达,其中免疫组化结果示ABCG2阳性细胞约占10%。结论:A549细胞系中SP细胞亚群具有自我更新能力以及比非SP细胞亚群强大的致瘤能力。A549细胞系SP细胞亚群对化疗敏感性的体外实验研究目的:探讨A549细胞系SP细胞亚群对化疗药物的敏感性及其耐药机制。方法:药敏试验检测SP及非SP细胞亚群对临床上治疗肺癌的常用药物DDP、5-FU、VP16、NVB以及GEM的敏感性,分别计算经化疗药作用24小时后各自的IC50;以上述5种化疗药对非SP细胞的IC50处理两亚群细胞2小时后,用高效液相色谱仪检测其细胞内药物浓度,并进行统计分析。结果:两亚群细胞经DDP作用后的IC50差别无统计学意义（P＞0.05）,细胞内药物浓度比较,差别亦无统计学意义（P＞0.05）;但SP亚群对其它4种化疗药的IC50均大于非SP细胞（P＜0.01）,经化疗药处理后,其细胞内药物浓度均低于非SP细胞（P＜0.01）。结论:A549细胞系SP细胞亚群具有比非SP细胞亚群更强的对化疗药的耐药性,其耐药与SP细胞外排化疗药密切相关。

论文目录

• 致谢
• 主要英文缩写
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 肿瘤干细胞研究现状（文献综述）
• 前言
• 1 干细胞简介
• 2 肿瘤干细胞理论的提出
• 3 干细胞和肿瘤细胞的比较
• 4 肿瘤干细胞存在的证据
• 5 肿瘤干细胞的起源
• 6 肿瘤干细胞的生物学特性
• 7 肿瘤干细胞在肺癌发生发展中的作用
• 8 肿瘤干细胞与化疗的关系
• 9 肿瘤干细胞的分离
• 10 针对肿瘤干细胞治疗的思路及实验现况
• 11 肿瘤干细胞研究存在的问题
• 12 本项目研究的目的和科研流程
• 参考文献
• 第二章 肺癌组织中ABCG2的表达及其临床价值
• 前言
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 A549细胞系SP细胞亚群的分离鉴定
• 前言
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第四章 A549细胞系SP细胞亚群生物学特性的体外实验研究
• 前言
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第五章 A549细胞系SP细胞亚群生物学特性的体内实验研究
• 前言
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第六章 A549细胞系SP细胞亚群对化疗敏感性的体外实验研究
• 前言
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文小结
• 攻读学位期间发表论文