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用于生物传感器的氧化还原酶蛋白固定化技术研究

2020-12-07阅读(359)

用于生物传感器的氧化还原酶蛋白固定化技术研究

论文摘要

生物大分子如何被持久、高效并保持活性状态固定在生物传感表面,同时保证生化反应信号迅速而充分地被信号转换元件所采集,是生物传感器研究的重要课题。氧化还原酶类催化底物分子的氧化还原反应,反应过程中转移的电子可被电化学检测仪器捕获,或者产生颜色变化可通过紫外-可见分光光度计来检测,易于获得可定量测定的信号变化,因而适合充当生物传感器的分子识别元件,并作为量化评价酶固定化效果的模式分子。本论文选择三种在生物传感器中广泛应用的氧化还原酶蛋白:胆碱氧化酶（ChOx）、葡萄糖氧化酶（GOx）和辣根过氧化物酶（HRP）来研究两类蛋白质固定化技术,分别为疏水蛋白自组装薄膜固定化ChOx和GOx,以及聚电解质层层累积微胶囊固定化HRP。疏水蛋白是一类由丝状真菌产生的外分泌蛋白,包含约100个氨基酸残基。其分子的表面结构包括一个4 nm2大小的平整的连续疏水区域,其余部分为亲水性,是一个典型的两亲性分子,具有极强的界面活性,能够显著降低水的表面张力,并在多种表面自组装形成高度有序的纳米级结构薄膜,同时改变表面对水的湿润性,帮助真菌在多种环境条件下完成表面吸附或冲破水面生长。根据氨基酸序列疏水模式及蛋白质生物物理特点的差异,疏水蛋白分为Ⅰ型和Ⅱ型,本论文研究了来源于瑞氏木霉Trichoderma reesei的Ⅱ型疏水蛋白HFBI在金属表面的自组装行为,及其用作电流型生物传感器的酶固定化基质的可行性,致力于构建完全由蛋白质修饰、能够最大程度利用固定化酶的催化活力的酶电极。石英晶体微天平（QCM）实验结果证实了HFBI在铂表面的自组装行为,并显示HFBI自组装量受酸碱度影响不明显,而随HFBI浓度增加呈非线性增长。通过循环伏安法检测铂电极表面HFBI自组装薄膜的通透性,验证了QCM实验结果,即浓度较高的HFBI溶液能够在铂表面自组装形成更为致密的疏水蛋白薄膜,表现为较高的蛋白质自组装量和较低的通透性。筛选出了适于构建生物传感器的适当HFBI浓度,由20μg/mL HFBI自组装形成的疏水蛋白薄膜,能够允许信号分子过氧化氢通过,同时有效屏蔽电活性干扰物质抗坏血酸、尿酸和醋氨酚到达电极表面。在生物传感表面构造亲水性微环境有利于酶蛋白保持活性构象,通过测定HFBI自组装薄膜修饰前后金表面与水的接触角变化,证明该薄膜能够显著而且稳定地提高金表面的亲水性。在HFBI自组装薄膜修饰的金表面通过物理吸附成功地固定化了ChOx,酶的表面覆盖率为3366 ng·cm-2,固定化后ChOx的最适pH值由游离酶的pH 8.0转变为pH 7.6,表观米氏常数Kmapp为1.27 mM,与游离酶Km值接近。在+400 mV工作电位下,基于Au/HFBI/ChOx电极的胆碱生物传感器各项性能指标良好,最低检测限为0.01 mM（信噪比=3）,线性范围0.01-1.0mM,灵敏度2184.06458 nA·mM-1,表现出抗干扰性能和较长的使用寿命,对酶活力的利用效率显著优于已报道的同类胆碱生物传感器。在HFBI自组装薄膜修饰的铂表面通过静电吸附成功固定化了GOx,酶的表面覆盖率为859 ng·cm-2,固定化后GOx的表观米氏常数Kmapp等于14.8 mM,略低于游离酶Km值。在+400 mV工作电位下,基于Pt/HFBI/GOx电极的葡萄糖生物传感器各项性能指标良好,最低检测限为0.12 mM（信噪比=3）,线性范围0.5-20 mM,灵敏度0.29806μA·mM-1,表现出抗干扰性能和较长的使用寿命,对酶活力的利用效率显著优于已报道的同类葡萄糖生物传感器。本论文首次将Ⅱ型疏水蛋白应用于电流型生物传感器,获得了高性能的胆碱和葡萄糖生物传感器,并提供了两种基于疏水蛋白HFBI自组装薄膜的、简单高效的酶蛋白固定化策略。本论文还报道了一种操作流程简化、条件温和、能够稳定固定化酶蛋白的微胶囊制备技术。使用包含HRP并带有负电荷的碳酸钙微粒作为模板,通过带有相反电荷的两种聚电解质:聚烯丙基胺盐酸盐（PAH）和聚苯乙烯磺酸钠（PSS）交替累积,在模板表面形成（PAH/PSS）5自组装薄膜,溶解模板后获得了形态大小均一、平均直径约6μm、分散度较好的HRP-（PAH/PSS）5微胶囊,50天内HRP向微胶囊外释放量维持在总固定化量的6%以内。应用紫外-可见分光光度法测定微胶囊对HRP显色底物的催化活性,30天内对邻苯三酚的催化活力降低不超过20%。所制备的微胶囊表现出一定程度的选择透过性,有可能在用于生物传感器构建时提高对底物的专一性,并屏蔽部分干扰物质,应用于酚类环境污染控制。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 引言
  • 第一节 生物传感器
  • 1.1.1 生物传感器的概念
  • 1.1.2 生物传感器的组成
  • 1.1.3 生物传感器的特点
  • 1.1.4 生物传感器的分类
  • 1.1.5 生物传感器的应用
  • 第二节 酶的固定化
  • 1.2.1 酶的概念
  • 1.2.2 酶的国际系统分类法
  • 1.2.3 酶的催化特性
  • 1.2.4 固定化酶的意义
  • 1.2.5 酶的固定化方法
  • 1.2.6 固定化酶的性质
  • 第三节 本论文的研究内容
  • 第二章 疏水蛋白的表面自组装研究
  • 第一节 实验设计
  • 第二节 实验部分
  • 2.2.1 实验材料与主要试剂
  • 2.2.2 实验仪器
  • 2.2.3 实验方法
  • 第三节 结果与讨论
  • 2.3.1 疏水蛋白HFBI的定性分析
  • 2.3.2 疏水蛋白HFBI在QCM铂基片表面的自组装实时监控
  • 2.3.3 铂电极表面疏水蛋白自组装薄膜通透性研究
  • 第四节 本章小结
  • 第三章 通过疏水蛋白自组装在金表面固定化胆碱氧化酶
  • 第一节 实验设计
  • 第二节 实验部分
  • 3.2.1 实验材料与主要试剂
  • 3.2.2 溶液配制
  • 3.2.3 实验仪器
  • 3.2.4 实验方法
  • 第三节 结果与讨论
  • 3.3.1 疏水蛋白HFBI修饰前后的金表面湿润性测试
  • 3.3.2 QCM金基片表面疏水蛋白HFBI自组装薄膜在不同pH下的稳定性
  • 3.3.3 QCM金基片表面疏水蛋白HFBI自组装固定化ChOx的实时监控
  • 3.3.4 修饰有疏水蛋白HFBI和ChOx的金表面形貌表征
  • 3.3.5 Au/HFBI/ChOx电极对胆碱的循环伏安响应
  • 3.3.6 基于Au/HFBI/ChOx电极的胆碱生物传感器工作曲线
  • 3.3.7 工作pH对胆碱生物传感器响应电流的影响
  • 3.3.8 基于Au/HFBI/ChOx电极的胆碱生物传感器的抗干扰性
  • 3.3.9 基于Au/HFBI/ChOx电极的胆碱生物传感器的使用寿命
  • 3.3.10 金表面疏水蛋白HFBI自组装薄膜的生物相容性
  • 3.3.11 不同电极材料表面修饰HFBI/ChOx的对照实验
  • 第四节 本章小结
  • 第四章 通过疏水蛋白自组装在铂表面固定化葡萄糖氧化酶
  • 第一节 实验设计
  • 第二节 实验部分
  • 4.2.1 实验材料与主要试剂
  • 4.2.2 溶液配制
  • 4.2.3 实验仪器
  • 4.2.4 实验方法
  • 第三节 结果与讨论
  • 4.3.1 QCM铂基片表面疏水蛋白HFBI自组装固定化GOx的实时监控
  • 4.3.2 修饰有疏水蛋白HFBI和GOx的铂表面形貌表征
  • 4.3.3 Pt/HFBI/GOx电极对葡萄糖的电流响应
  • 4.3.4 不同电极材料表面修饰HFBI/GOx的对照实验
  • 4.3.5 基于Pt/HFBI/GOx电极的葡萄糖生物传感器工作曲线
  • 4.3.6 基于Pt/HFBI/GOx电极的葡萄糖生物传感器的抗干扰性
  • 4.3.7 基于Pt/HFBI/GOx电极的葡萄糖生物传感器的使用寿命
  • 4.3.8 铂表面疏水蛋白HFBI自组装固定化GOx的酶利用效率
  • 第四节 本章小结
  • 第五章 利用聚电解质层层累积微胶囊固定辣根过氧化物酶
  • 第一节 实验设计
  • 第二节 实验部分
  • 5.2.1 实验材料与主要试剂
  • 5.2.2 实验仪器
  • 5.2.3 实验方法
  • 第三节 结果与讨论
  • 3模板的制备'>5.3.1 微胶囊CaCO3模板的制备
  • 3/（PAH/PSS）5微颗粒的制备'>5.3.2 CaCO3/（PAH/PSS）5微颗粒的制备
  • 5.3.3（PAH/PSS）5微胶囊的制备
  • 5微胶囊的形态稳定性'>5.3.4（PAH/PSS）5微胶囊的形态稳定性
  • 5微胶囊的形态观察'>5.3.5（FITC-PAH/PSS）5微胶囊的形态观察
  • 5微胶囊形态观察'>5.3.6 包裹有FITC-HRP的（PAH/PSS）5微胶囊形态观察
  • 5.3.7 紫外-可见分光光度法检测微胶囊中所固定化的HRP含量
  • 5.3.8 荧光分光光度法测定微胶囊中所固定化的HRP含量
  • 5.3.9 荧光分光光度法测定微胶囊内容物释放速率
  • 5薄膜累积状况的QCM监控'>5.3.10（PAH/PSS）5薄膜累积状况的QCM监控
  • 5微胶囊的制备'>5.3.11（PSS/PAH）5微胶囊的制备
  • 4微胶囊的制备'>5.3.12（PEI/PSS）4微胶囊的制备
  • 第四节 本章小结
  • 第六章 固定在聚电解质层层累积微胶囊中的酶活性测试
  • 第一节 实验设计
  • 第二节 实验部分
  • 6.2.1 实验材料与主要试剂
  • 6.2.2 实验仪器
  • 6.2.3 实验方法
  • 第三节 结果与讨论
  • 5微胶囊的催化活力'>6.3.1 以ABTS为底物时HRP-（PAH/PSS）5微胶囊的催化活力
  • 5微胶囊的催化活力'>6.3.2 以邻苯三酚为底物时HRP-（PAH/PSS）5微胶囊的催化活力
  • 5微胶囊制备条件优化'>6.3.3 HRP-（PAH/PSS）5微胶囊制备条件优化
  • 5微胶囊的催化活力'>6.3.4 优化条件制备的HRP-（PAH/PSS）5微胶囊的催化活力
  • 5微胶囊的保存寿命'>6.3.5 优化条件制备的HRP-（PAH/PSS）5微胶囊的保存寿命
  • 第四节 本章小结
  • 第七章 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果

    • 相关论文文献

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