疏绵状嗜热丝孢菌热稳定几丁质酶纯化及其编码基因的克隆与表达

论文题目: 疏绵状嗜热丝孢菌热稳定几丁质酶纯化及其编码基因的克隆与表达

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物病理学

作者: 郭润芳

导师: 李多川

关键词: 疏绵状嗜热丝孢菌,热稳定几丁质酶,纯化,克隆,表达

文献来源: 山东农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 几丁质酶因其在各个领域潜在的应用价值而倍受关注,它除了被用于植物病原真菌和害虫的生物防治;可以用作外敷药物治疗由真菌引起的人类疾病;可以制备酵母和丝状真菌的原生质体,进行菌株改良。近年来,几丁质酶还用于几丁质的生物转化。几丁质经几丁质酶部分水解后产生生物活性物质几丁寡糖,被广泛应用在农业、医药、化工、食品、环境等许多领域。但采用化学方法控制几丁质降解,难度大,成本高,对环境污染严重。采用生物降解不仅有效的克服了这些问题,而且可以提高资源利用,增加经济效益。国内外已筛选出多种几丁质酶生产菌,并将其分离提纯。但市场应用的几丁质酶主要来源于常温菌,因产品成本高,热稳定性差,货架寿命短, 酶活力和产率低而制约几丁质酶在农业、工业上的应用。由此可见,热稳定性几丁质酶的研究和开发具有重要的商业价值。尽管已经分离了许多种几丁质酶,相关的基因也已克隆和表达,但有关热稳定性几丁质酶的研究却很少。目前仅从极端耐热古细菌Thermococcus chitonophagus、Thermococcus kodakaraensis KOD1、以及细菌Bacillus BG-11、、Streptomyces OPC520、等中分离到对热稳定的几丁质酶,而来源于嗜热真菌的热稳定几丁质酶还未见报道。疏绵状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus）是一种广泛分布的,生长上限温度较高的一种嗜热真菌,从该菌中已分离了多种嗜热酶,但未见嗜热几丁质酶的报道。本研究中Thermomyces lanuginosus 在以胶状几丁质为唯一碳源的合成培养基中诱导产生了胞外几丁质酶,通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow 阴离子层析、Phenyl-Sepharose 疏水层析等步骤获得了凝胶电泳均一的几丁质酶。SDS-PAGE 测得所分离纯化酶蛋白的分子量约为48kDa。该酶的最适反应温度和pH 分别为55℃和4.5。在pH4.5 条件下,该酶在50℃以下稳定,65℃的半衰期为25min;70℃保温20min 后,仍保留24%的酶活性。Ca2+、Na+、K+、Ba2+对酶有激活作用,一些重金属离子Ag+、Hg2+对酶有显著的抑制作用。而且该酶对齐整小核菌（Sclerotium rolfsii）和小麦纹枯病菌（Rhizoctonia cerealis）的菌丝生长,

论文目录:

摘要

Abstract

第一章文献综述

引言

1 真菌几丁质酶的研究进展

1.1 真菌几丁质酶的组成

1.2 真菌几丁质酶的产生

1.2.1 产几丁质酶真菌的筛选

1.2.2 真菌几丁质酶的产生条件

1.3 真菌几丁质酶的基本性质

1.4 真菌几丁质酶基因的分子生物学研究

1.4.1 真菌几丁质酶基因的克隆

1.4.2 真菌几丁质酶基因的结构

1.4.3 真菌几丁质酶基因的表达调控

1.4.4 真菌几丁质酶基因的表达转化

1.4.5 真菌几丁质酶的空间结构和催化功能

1.5 真菌几丁质酶的应用

1.5.1 几丁质酶在生物学研究方面的应用

1.5.2 用作生防制剂

1.5.3 利用几丁质酶降解渔业废物,实现几丁质的生物转化

1.6 发展趋势

2 本研究的立论依据及研究意义

第二章疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)热稳定性几丁质酶的纯化及特性

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试菌株

1.1.2 培养基

1.1.3 主要仪器和试剂

1.2 实验方法

1.2.1 培养条件

1.2.2 培养时间对几丁质酶产生的影响

1.2.3 酶活力测定

1.2.4 蛋白质含量测定

1.2.5 Thermomyces lanuginosus 几丁质酶的分离纯化

1.2.6 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量和纯度鉴定

1.2.7 N-端氨基酸测定

1.2.8 几丁质酶酶学特性的研究

2 结果与分析

2.1 不同培养时间对几丁质酶活性的影响

2.2 酶的分离纯化

2.2.1 DEAE-Sepharose 阴离子交换柱层析

2.2.2 Phenyl-Sepharose 疏水柱层析

2.2.3 几丁质酶纯化过程总表

2.2.4 几丁质酶分子量和纯度鉴定

2.3 几丁质酶的特性研究

2.3.1 最适反应温度

2.3.2 最适反应pH

2.3.3 酶的热稳定性

2.3.4 酶的pH 稳定性

2.3.5 不同金属离子对酶活性的影响

2.3.6 变性剂和蛋白酶抑制剂对几丁质酶活性的影响

2.3.6 几丁质酶的反应动力学曲线

2.4 N-端氨基酸序列测定

2.5 几丁质酶的储存稳定性

2.6 酶的抗菌活性

3 讨论

3.1 Thermomyces lanuginosus 几丁质酶的纯化方法

3.2 Thermomyces lanuginosus 几丁质酶的稳定性

3.3 Thermomyces lanuginosus 几丁质酶活性与金属离子的关系

3.4 Thermomyces lanuginosus 几丁质酶的抗菌活性

3.5 Thermomyces lanuginosus 几丁质酶的应用潜力和存在的问题

第三章嗜热真菌热稳定性几丁质酶基因的cDNA 克隆及其序列分析

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

1.1.2 菌株与质粒

1.1.3 酶和生化试剂

1.1.4 仪器

1.1.5 培养基

1.1.6 溶液配制

1.1.7 PCR 引物

1.2 实验方法

1.2.1 总RNA 的提取(Trizol 法)

1.2.2 紫外检测RNA 产率和纯度

1.2.3 反转录cDNA 第一链的合成

1.2.4 目的基因cDNA 中间片段的分离

1.2.5 目的基因3’末端的分离(3’-RACE)

1.2.6 目的基因5’末端的分离(5’-RACE)

1.2.7 目的基因全长cDNA 的克隆

1.2.8 全长序列的生物信息学分析

2 结果与分析

2.1 Thermomyces lanuginosus 总RNA 的提取

2.2 几丁质酶基因中间片段的分离

2.2.1 Thermomyces lanuginosus 几丁质酶基因中间片段的分离

2.2.2 Thermoascus aurantiacus 几丁质酶基因片断的克隆及序列分析

2.3 Thermomyces lanuginosus 几丁质酶基因3’-末端cDNA 的分离

2.4 Thermomyces lanuginosus 几丁质酶基因cDNA 5’-末端的分离

2.5 Thermomyces lanuginosus 几丁质酶基因全长cDNA 的分离及扩增片断的序列拼接

2.6 几丁质酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析

2.6.1 几丁质酶基因chit 的核苷酸序列分析

2.6.2 几丁质酶基因chit 的氨基酸序列分析

2.6.3 几丁质酶氨基酸组成

2.6.4 几丁质酶CHIT 的二级结构预测

3 讨论

3.1 利用RACE 技术分离功能基因

3.2 Thermomyces lanuginosus 几丁质酶chit 基因结构探讨

第四章 Thermomyces lanuginosus 热稳定几丁质酶基因在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

1.1.2 酶和生化试剂

1.1.3 培养基及有关溶液的配制

1.1.4 主要仪器设备

1.2 试验方法

1.2.1 几丁质酶CHIT 成熟肽基因序列的分离

1.2.2 几丁质酶基因在大肠杆菌中的表达

1.2.3 几丁质酶基因在毕赤酵母中的表达

2 结果与分析

2.1 几丁质酶成熟肽基因序列的分离

2.2 几丁质酶基因在大肠杆菌中的表达

2.2.1 几丁质酶基因重组表达载体的构建

2.2.2 几丁质酶基因的诱导表达

2.2.3 表达蛋白的可溶性分析

2.3 几丁质酶基因chit 在毕赤酵母中的表达

2.3.1 酵母表达载体的构建和鉴定

2.3.2 重组酵母表达质粒pPIC9K/chit 转化 Pichia pastoris GS115 及酵母转化子的筛选

2.3.3 疏绵状嗜热丝孢菌热稳定几丁质酶chit 基因在Pichia pastoris 中的高效表达及表达产物的检测

3 讨论

3.1 外源chit 基因在E. coli 中的表达

3.2 影响Pichia pastoris 表达系统表达重组几丁质酶的因素

3.3 表达几丁质酶的酶学特性

第五章结论和建议

5.1 结论

5.2 建议

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况

发布时间: 2005-10-11

参考文献

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[7].产几丁质酶海洋放线菌C203的分离鉴定及其酶基因的克隆[D]. 蔡海宝.华南热带农业大学2007
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