大鼠脂肪间充质干细胞分化为肝细胞样细胞的研究

论文摘要

目前对于终末期肝病和部分遗传性肝病缺乏理想的治疗措施,以补充功能性肝细胞为思路的细胞治疗和生物人工肝即是一个大胆、有益的尝试。但因肝细胞不能取材于自体,且同种肝细胞数量和保存时间有限,使其临床应用受到限制。因此,必需寻找其他来源细胞替代肝细胞,成体干细胞多向分化潜能的发现给人们带来了新的希望。成体干细胞中以骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs）和脐血间充质干细胞（umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells,UCBMSCs）向肝细胞分化报道较多。自2001年Zuk等人[1]发现人脂肪组织中存在具有多向分化潜能的干细胞以来,脂肪间充质干细胞（adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, ADMSCs）以其来源广泛、取材方便、自体取材创伤小等独特优点而很快成为人们的研究热点。研究表明ADMSCs在适当条件下可以向脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞、心肌细胞、神经细胞、内皮细胞等方向诱导分化,而向肝细胞方向分化报道较少。脂肪间充质干细胞向肝细胞分化潜能的研究将有望为肝病的细胞治疗和生物人工肝提供大量新的、很有前景的细胞来源。本研究旨在通过体内外不同诱导途径探讨ADMSCs向肝细胞分化的潜能。首先获取大鼠脂肪组织,用胶原酶消化法分离出干细胞,并进行体外扩增、传代;用免疫荧光染色法检测其表面标志,并诱导ADMSCs向脂肪细胞、成骨细胞、神经胶质细胞等方向分化,以鉴定所获取的细胞是否为间充质干细胞。用成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor , FGF-4）和肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor , HGF）诱导其向肝细胞分化;倒置显微镜观察细胞形态变化,诱导后14天和21天分别用免疫荧光检测法检测肝细胞标志物白蛋白的表达,用尿素氮测试盒检测培养上清液尿素氮含量。通过以上指标的测定,研究ADMSCs在体外诱导条件下向肝细胞分化的能力。随后我们以同样的方法从大鼠脂肪组织中分离出干细胞,并进行体外扩增、传代,取第2代ADMSCs用PKH26标记,制作部分肝切除模型,将标记细胞经门静脉自体植入体内。2周后切下肝脏制成冰冻切片,荧光显微镜下观察标记细胞在肝脏中的定位,免疫荧光染色检测标记细胞白蛋白的表达。结果表明,从脂肪组织所获取的细胞经免疫荧光检测显示其表面分子CD29（+）,而CD31和CD45均为阴性,通过不同的诱导方法细胞能够被诱导向脂肪细胞、成骨细胞、神经胶质细胞等方向分化,证实我们从脂肪组织获取的细胞为具有多向分化潜能的干细胞;诱导14天后可逐渐观察到肝细胞样形态改变;免疫荧光检测到白蛋白表达;尿素氮检测显示诱导组尿素氮含量随时间延长而逐渐升高。从脂肪组织中分离出的ADMSCs能在体外大量扩增,PKH26标记后该细胞在荧光显微镜下发红色荧光,细胞标记率约95%;荧光显微镜下可见肝脏冰冻切片中散在分布红色标记细胞,免疫荧光染色显示大多数标记细胞白蛋白染色阳性。综上所述,通过我们的实验方法,可以从大鼠脂肪组织中获取具有多向分化潜能的干细胞,即脂肪间充质干细胞（ADMSC）,该细胞能在体外被诱导分化成形态、表型及功能与肝细胞相似的细胞;体内移植实验显示,ADMSCs也能在部分肝切除后的肝再生环境中向肝细胞分化,有可能在肝部分切除后参与肝再生。本研究通过体内外实验表明ADMSCs在适当条件可以被诱导分化为肝细胞,为ADMSCs在肝病的细胞治疗、生物人工肝和肝脏组织工程中的应用提供了一定的实验依据。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 1 干细胞的研究
• 2 脂肪间充质干细胞的研究进展
• 3 干细胞向肝细胞方向分化的研究
• 4 细胞体内移植的示踪方法
• 正文
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 2.1 大鼠脂肪间充质干细胞的分离培养及鉴定
• 2.2 体外诱导大鼠ADMSCs 向肝细胞分化的实验
• 2.3 ADMSCs 在部分肝切除模型中向肝细胞方向分化的实验
• 3 实验结果
• 3.1 大鼠脂肪间充质干细胞的分离培养及鉴定结果
• 3.2 体外诱导大鼠ADMSCs 向肝细胞分化的实验结果
• 3.3 ADMSCs 在部分肝切除模型中向肝细胞方向分化的实验结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历
• 硕士期间发表论文情况
• 致谢