论文题目: 棉铃虫对Bt毒素—Cry1Ac抗性的生化及分子机理研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 农业昆虫与害虫防治
作者: 许新军
导师: 吴益东
关键词: 棉铃虫,苏云金杆菌,毒素,类受体,抗性
文献来源: 南京农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 转基因Bt棉对棉铃虫具有很好的杀虫效果,其种植面积占我国棉花总面积的三分之二。但是棉铃虫对Bt棉的抗性将直接影响Bt棉的使用寿命。棉铃虫对Bt毒素抗性机理的阐明将有助于从分子水平上找到可靠的检测方法,从而能准确监测棉铃虫对Bt棉的抗性发展,为制定合理的抗性治理措施以延长Bt棉的使用寿命提供依据。 一、棉铃虫对Cry1Ac毒素抗性品系筛选 在实验室内用活化的Cry1Ac毒素对2001年采自河北高阳的棉铃虫进行了28代的连续筛选,获得了GYBT抗性品系,该抗性品系对Cry1Ac的抗性水平高达800倍以上。2002年对采自全国10个县市的三、四代田间棉铃虫种群进行了抗性水平的监测,结果表明棉铃虫不同地理种群对活化的Cry1Ac毒素的敏感性差异较大。 二、棉铃虫中肠蛋白酶活性测定、酶谱及降解毒素分析 分别用类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶、氨肽酶及总蛋白酶的专性底物比较了抗性和敏感棉铃虫中肠的蛋白酶活性。结果表明类胰蛋白酶及氨肽酶对底物的活性及亲合力在抗性和敏感品系间没有明显差异;而GYBT抗性品系的类胰凝乳蛋白酶活性低于敏感品系,但GYBT品系的总蛋白酶活性却高于敏感品系,类胰凝乳蛋白酶及总蛋白酶对底物亲合力的变化与之相反。TLCK,TPCK及PMSF三种蛋白酶抑制剂对中肠蛋白酶的活性抑制测定表明:抗性品系中肠内的类胰凝乳蛋白酶及总蛋白酶的抑制率明显低于敏感品系。在棉铃虫中肠蛋白酶的变性及非变性酶谱分析中,抗性品系中肠蛋白酶的结构组成不同于敏感品系——产生了一条新的蛋白酶。在离体条件下用抗性和敏感品系中肠蛋白酶液对Cry1Ac进行降解,结果表明蛋白酶对毒素的降解作用在抗性和敏感品系之间没有明显的不同。因此,GYBT抗性品系棉铃虫中肠蛋白酶结构组成发生了一些改变,但只是棉铃虫对外源食物的一种适应,而不是导致抗性的主要因素。 三、棉铃虫Cadherin类受体基因克隆及抗性遗传连锁分析 采用PCR及3’RACE技术,分别从棉铃虫敏感(GY)和抗性品系(GYBT)
论文目录:
中文摘要
英文摘要
符号及缩略语
第一章 文献综述
1 棉铃虫抗性研究概况
1．1 棉铃虫的分布及为害
1．2 棉铃虫的防治与抗药性
2 苏云金芽孢杆菌
2．1 苏云金芽孢杆菌的发现
2．2 毒素分类
2．3 毒素的结构研究
2．4 毒素的作用及穿孔机理
2．5 苏云金芽孢杆菌的应用
3 Bt毒素在昆虫中肠内的结合受体
3．1 APN类受体
3．2 Cadherin类受体
3．3 昆虫中的其它结合受体
4 昆虫对Bt毒素的抗性
4．1 昆虫对Bt毒素的抗性概况
4．2 昆虫对Bt毒素的抗性机理
4．3 昆虫对Bt抗性机理研究中需要探讨的一些问题
5 棉铃虫对Cry1Ac毒素抗性机理研究的目的和意义
第二章 棉铃虫对Cry1Ac抗性品系的筛选
1 材料与方法
1．1 试验材料
1．1．1 供试昆虫
1．1．2 供试药剂
1．1．3 试验器具
1．2 生物测定方法(毒素涂表法)
1．3 抗性筛选
1．4 抗性监测
2 结果与分析
2．1 抗性筛选
2．2 田间棉铃虫抗性监测
3 讨论
第三章 棉铃虫中肠蛋白酶活性测定及酶谱分析
1 材料与方法
1．1 试验材料
1．1．1 供试昆虫
1．1．2 主要试剂
1．1．3 主要仪器
1．2 试验方法
1．2．1 棉铃虫中肠蛋白酶的制备
1．2．2 中肠总蛋白酶(Azocasein)活性测定
1．2．3 中肠类胰蛋白酶(BApNA)活性测定
1．2．4 中肠类胰凝乳蛋白酶活性测定
1．2．5 中肠氨肽酶(L-pNA)活性测定
1．2．6 中肠酯酶和谷胱甘肽—S—转移酶活性测定
1．2．7 PMSF、TPCK及TLCK抑制作用测定
1．2．8 中肠蛋白酶native-PAGE酶谱分析
1．2．9 中肠蛋白酶SDS-PAGE酶谱分析
1．2．10 中肠蛋白酶降解CrylAc毒素分析
1．2．11 PMSF、TPCK及TLCK抑制中肠蛋白酶降解Cry1Ac毒素分析
1．2．12 蛋白质含量测定
2 结果与分析
2．1 中肠蛋白酶及解毒酶活性
2．2 PMSF、TPCK及TLCK抑制作用测定
2．3 中肠蛋白酶native-PAGE酶谱分析
2．4 中肠蛋白酶SDS-PAGE酶谱分析
2．5 中肠蛋白酶降解Cry1Ac毒素分析
2．6 PMSF、TPCK及TLCK抑制中肠蛋白酶降解Cry1Ac毒素分析
3 讨论
第四章 棉铃虫中肠Cadherin类受体基因克隆及遗传分析
1 材料与方法
1．1 试验材料
1．1．1 供试昆虫
1．1．2 主要试剂
1．1．3 主要仪器
1．2 试验方法
1．2．1 中肠总RNA的制备
1．2．2 模板cDNA合成
1．2．3 DNA制备
1．2．3．1 试剂准备
1．2．3．2 基因组DNA提取
1．2．4 PCR引物设计
1．2．5 PCR反应
1．2．6 PCR产物的回收纯化、克隆及测序测定
1．2．6．1 PCR产物的回收纯化
1．2．6．2 连接反应
1．2．6．3 转化大肠杆菌
1．2．6．4 小量质粒DNA的提取
1．2．6．5 质粒中转化产物检测
1．2．6．6 序列测定
1．2．7 抗性遗传连锁分析
1．2．8 棉铃虫对Cry1Ac毒素抗性基因组水平的分子检测
2 结果与分析
2．1 敏感及抗性品系Cadherin类受体的克隆
2．2 敏感及抗性品系Cadherin类受体比较分析
2．3 抗性遗传连锁分析
2．4 棉铃虫对Cry1Ac毒素抗性基因组水平的分子检测
2．4．1 引物筛选
2．4．2 棉铃虫Cadherin受体基因在基因组上的片段克隆
2．4．3 棉铃虫基因组中Cadherin类受体基因分布
2．4．4 基因组水平F2代抗性遗传连锁分析
3 讨论
第五章 棉铃虫中肠受体与Cry1Ac毒素结合分析
1 材料与方法
1．1 试验材料
1．1．1 供试昆虫
1．1．2 主要试剂
1．1．3 主要仪器
1．2 试验方法
1．2．1 棉铃虫中肠BBMV的制备
1．2．2 Cry1Ac毒素的~(125)Ⅰ标记
1．2．3 Cry1Ac毒素的biotin标记
1．2．4 Cry1Ac毒素与受体的Western Blot
1．2．5 Cry1Ac毒素与受体结合动力学分析
1．2．5．1 结合试验方法
1．2．5．2 饱和结合试验
1．2．5．3 同源竞争结合试验
1．2．5．4 数据分析
1．2．6 蛋白质含量测定
2 结果与分析
2．1 棉铃虫中肠BBMV与Cry1Ac毒素的饱和结合
2．2 棉铃虫中肠BBMV与Cry1Ac毒素的同源竞争结合
2．3 Cry1Ac毒素与抗性、敏感棉铃虫中肠BBMV杂交比较分析
3 讨论
全文总结
参考文献
附表1
附表2
附表3
附录：发表学术论文
致谢
发布时间: 2005-07-19
参考文献
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