论文摘要
支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb是引起动物呼吸道疾病的一种重要病原菌,可广泛感染家畜、野生动物和实验动物呼吸道上皮,能引起猪、马、猫、狗、兔、小鼠、豚鼠等哺乳动物的呼吸道疾病,常导致感染动物发生鼻炎和支气管肺炎。人也有感染该菌的报道,尤其是小孩和免疫力缺陷的人群。该菌在兔群中感染率非常高,危害家兔健康,危害兔产业的健康发展。百日咳杆菌粘附素（pertactin, PRN）是Bb的主要保护性抗原,存在于菌体外膜上。PRN还是Bb定植过程中的重要黏附因子,是Bb定植过程的关键。研究表明,PRN能够显著降低Bb在免疫小鼠肺脏的定植水平。因此本试验将prn基因进行了克隆,表达,并对其免疫保护特性进行了研究；同时本试验还利用重组蛋白PRN作为包被抗原建立了检测支气管败血波氏杆菌血清抗体的间接ELISA诊断方法。试验结果如下1.参照GenBank公布的猪源支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica, Bb）的prn基因序列（AY376325）设计了一对特异性扩增相应核苷酸片段的上、下游引物。将PCR扩增产物克隆入pMD19-Tvector,经酶切鉴定、测序正确后,将目的片段连接至原核表达载体pGEX-4T-1载体中,构建原核表达载体为pGEX-4T-1-prn。将此表达载体质粒转化E.coli BL21（DE3）,表达并纯化重组蛋白,SDS-PAGE电泳分析显示重组蛋白在IPTG诱导下主要以包涵体的形式高效表达,同时有少量以可溶形式存在于上清中；Western blot显示重组蛋白能被兔Bb特异性阳性血清识别,证明重组蛋白具有良好的反应原性,有望成为实用有效的诊断抗原和疫苗抗原。2.本试验应用表达的重组蛋白PRN为包被抗原,建立了一种检测支气管败血波氏杆菌血清抗体的间接ELISA诊断方法。试验确定重组蛋白PRN抗原的最佳包被浓度为500ng/mL,最佳封闭条件为2%的BSA37℃封闭1.5h,最适检测血清稀释度为1：40,血清最适作用时间为60min,酶标二抗最适稀释度为1:5000,最适作用时间为60min,底物最适显色时间为37℃,10min。试验证实该方法不仅敏感、特异、快速、简便,而且经济、易于重复,具有良好的应用前景。3.取支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica, Bb）断尾采血,用建立的间接ELISA测定其血清效价。用2×LD50Bb对免疫后小鼠进行腹腔注射攻毒,观察十天并记录小鼠死亡情况。结果显示浓度较高的两个重组蛋白PRN免疫组和灭活疫苗免疫组小鼠均没有死亡,存活率为100%。浓度最低的重组蛋白PRN免疫组小鼠死亡2只,存活率为66.7%。阴性对照组小鼠死亡5只,存活率仅为16.6%,空白对照组小鼠均死亡。死亡的小鼠死前均表现为食欲减退,精神不振,从其肝脏、肺脏均能够分离到形态典型的Bb菌。本研究成功表达了百日咳杆菌粘附素；重组蛋白PRN对ICR小鼠具有良好的免疫保护性；本研究还成功应用重组蛋白PRN建立了一种检测支气管败血波氏杆菌血清抗体的间接ELISA诊断方法。从而为该病的诊断和防制,以及疫苗的开发奠定了重要基础。
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标签：支气管败血波氏杆菌论文; 百日咳杆菌粘附素论文; 原核表达论文;