柑橘果实粒化变异体的遗传背景及其性状形成的机理研究

论文摘要

柑橘体细胞融合技术有效地克服了柑橘有性杂交过程中遇到的珠心胚干扰、雌雄败育等生殖障碍,近二十年来已创造了超过250例的不同种间、属间体细胞杂种材料。由于柑橘体细胞融合实际上是一个半筛选体系,理论上再生植株包括三类:四倍体体细胞杂种,二倍体胞质杂种以及悬浮亲本再生植株。而原生质体再生植株很容易产生体细胞无性系变异,因而能创造出一些特别的种质资源。本研究以由‘朋娜脐橙愈伤原生质体’+‘红橘叶肉原生质体’通过PEG融合后再生的6棵具有果实早期粒化症状的变异体植株为材料,首先从遗传背景上分析其来源,而后以朋娜脐橙（Citrus sinensis[L.]Osbeck）作为对照分析了两者果实在发育过程中细胞壁代谢的变化规律和相关基因的表达,并采用SSH结合反向Northern技术分析了两者差异表达的基因。主要研究结果如下:1.流式细胞仪的倍性测定显示变异植株均为二倍体,而几种分子标记,即核SSR,RAPD,cpSSR,mtCAPS和mtRFLP的结果表明,它们的DNA均来源于朋娜脐橙而缺少红橘的遗传信息,但在线粒体基因组上单株之间以及与朋娜脐橙都存在着一定程度的变异。而叶型指数与朋娜没有显著差异而与红橘差异显著,其中单株之间有差异;枝条与朋娜脐橙相似但其中单株1-3无刺而单株4-6有刺;其花期与朋娜脐橙一致而早于红橘,花的形态也与亲本不同;果实形态及生理分析表明其与两亲本有明显差异,果实表面粗糙,无种子,果实无脐,汁胞粒化现象严重,果实着色略早,可固、可滴定酸、Vc含量均低于朋娜。由此我们推测其可能是由朋娜脐橙悬浮细胞再生形成的体细胞无性系变异体。2.测定了不同发育时期粒化突变体与朋娜脐橙果实汁胞和果皮中果胶类物质和纤维素类物质的组成与含量变化以及相关水解酶类的活性变化。结果表明两者果皮中果胶类物质以及纤维素类物质没有显著差异,但在突变体果实汁胞中原果胶,纤维素,半纤维素,木质素含量显著高于朋娜脐橙,这些均是细胞壁结构的重要组成物质。其代谢途径的三个关键酶,果胶甲酯酶,多聚半乳糖醛酸酶以及纤维素酶活性在果实发育过程均明显低于朋娜脐橙同时期的酶活性,特别是成熟后期。3.利用Real-time PCR测定粒化突变体与朋娜脐橙果实中细胞壁代谢途径关键酶基因（果胶甲酯酶,多聚半乳糖醛酸酶以及纤维素酶）以及多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白在几个不同采样时期的表达。结果与酶活测定结果趋势一致,表明汁胞粒化与果实中这几种酶的活动密切相关。综合以上研究结果,认为粒化可能是由于纤维素代谢相关的基因以及抑制蛋白的表达发生变化,一方面导致纤维素酶活性变低,使纤维素、半纤维素分解速度减小,另一方面纤维素合成增多,分解速度小于合成速度,导致粒化发生,同时由于果胶酶水解原果胶生成脱甲酯果胶质,其中一部分被钙桥、酯键固定,果胶被凝胶化,进一步加重粒化。4.为了获得与粒化突变体果实特异性状相关的基因,我们构建了其与朋娜脐橙果实的抑制性差减文库（SSH文库）,然后采用反向Northern技术从文库中筛选在果实发育过程中差异表达的基因。在对差异表达的基因进行测序以及序列分析后,我们总共得到357条非重复性的基因,64.4%的非冗余序列（207条单一序列与23条contig）。其中与细胞代谢、初生代谢、定位以及大分子代谢等相关的基因数目最多。这些基因所属的代谢途径包括丙酮酸代谢途径、淀粉和蔗糖代谢途径、三羧酸代谢途径及糖酵解代谢途径等。此外,还对发现的12个与粒化性状可能相关的酶和蛋白候选基因,即果胶甲酯酶抑制蛋白（PMEIP）、果胶酸盐水解酶（PL）、几丁质酶（Chitinase）、葡聚糖酶（Glucanase）、β-半乳糖苷酶（Gal）、扩展蛋白（Exp）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）、赤霉素调节蛋白（GRP）、反转录转座子（Retrotransposon）和钙离子结合蛋白（CaBP）,对它们在6个不同发育时期的基因表达活性变化进行了Real-time PCR检测,发现它们也与粒化有一定的关联。本研究通过对从果实生长发育的整个阶段进行研究,从细胞壁结构物质含量的变化到相关合成及水解酶类的动态变化,然后结合抑制性差减杂交技术（SSH）、反向Northern杂交技术,后续的生物信息学分析以及荧光实时定量PCR技术,首次深入到基因表达的层面研究了粒化所涉及到的一系列变化,揭示了调控粒化形成的可能分子途径,为将来解决这一问题奠定了一定的基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 前言
• 1.1 课题提出
• 1.2 前人研究进展
• 1.2.1 植物体细胞无性系变异研究进展
• 1.2.1.1 植物体细胞无性系突变体产生的来源
• 1.2.1.2 植物体细胞无性系变异的遗传学基础
• 1.2.2 原生质体再生植株变异的研究进展
• 1.2.2.1 原生质体再生植株变异的主要类型
• 1.2.2.2原生质体再生植株变异的原因及影响因素
• 1.2.2.3 原生质体再生植株变异在育种上的应用
• 1.2.3 柑橘细胞融合与变异研究
• 1.2.3.1 柑橘原生质体融合方法
• 1.2.3.2 柑橘原生质体融合方式
• 1.2.3.2 柑橘体细胞融合后再生植株的遗传与变异研究
• 1.2.4 体细胞融合后再生植株变异的研究手段
• 1.2.4.1 细胞遗传学
• 1.2.4.2 生物化学
• 1.2.4.3 分子标记
• 1.2.4.4 差异显示技术
• 1.2.4.5 抑制消减杂交（SSH）
• 1.2.5 柑橘果实粒化研究进展
• 1.2.5.1 与柑橘汁胞粒化有关的因素
• 1.2.5.2 降低粒化的调控措施
• 1.3 本研究的目的与内容
• 第二章 变异体的遗传背景分析
• 2.1 材料
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 倍性分析
• 2.2.2 总DNA的提取、RAPD、SSR分析、CAPS、RFLP分析
• 2.2.2.1 DNA提取及检测
• 2.2.2.2 RAPD分析
• 2.2.2.3 SSR分析
• 2.2.2.4 cpSSR分析
• 2.2.2.5 mtCAPS分析
• 2.2.2.6 mtRFLP分析
• 2.2.3 植株的形态学观察
• 2.2.3.1 叶形指数的调查
• 2.2.3.2 气孔观察与比较
• 2.2.3.3 果实形态特征及生理指标测定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 倍性分析
• 2.3.2 核DNA来源
• 2.3.3 胞质DNA来源
• 2.3.4 突变体植株的形态学观察
• 2.3.4.1 叶形指数的调查
• 2.3.4.2 气孔观察与比较
• 2.3.4.3 果实形态,可溶性固形物,可滴定酸等生理指标的测定
• 2.4 讨论
• 第三章 粒化突变体果实发育过程中细胞壁代谢研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 细胞壁物质各组分的测定
• 3.1.2.1 果胶物质的测定:
• 3.1.2.2 纤维素,半纤维素,木质素含量的测定
• 3.1.3 果实细胞壁降解酶活性的测定
• 3.1.3.1 多聚半乳糖醛酸酶活性测定
• 3.1.3.2 果胶甲酯酶活性测定
• 3.1.3.3 纤维素酶活性测定
• 3.1.4 几种酶的基因表达实时定量分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 汁胞果胶、水溶性原果胶、总果胶含量变化
• 3.2.2 果皮果胶、原果胶、总果胶含量变化
• 3.2.3 汁胞纤维素,半纤维素,木质素含量变化
• 3.2.4 汁胞含水量变化
• 3.2.5 果皮纤维素,半纤维素,木质素含量变化
• 3.2.6 汁胞多聚半乳糖醛酸（PG）,果胶甲酯酶（PME）,纤维素酶（Cx）活性变化
• 3.2.7 果皮多聚半乳糖醛酸（PG）,果胶甲酯酶（PME）,纤维素酶（Cx）活性变化
• 3.2.8 几种酶的基因表达实时定量分析
• 3.2.8.1 汁胞中多聚半乳糖醛酸酶（PG）,果胶甲酯酶（PME）,纤维素酶（Cx）以及多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（PGIP）基因的表达分析
• 3.2.8.2 果皮中多聚半乳糖醛酸酶（PG）,果胶甲酯酶（PME）,纤维素酶（Cx）以及多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（PGIP）基因的表达分析
• 3.3 讨论
• 第四章:粒化突变体果实SSH文库构建与差异表达基因研究
• 4.1 实验材料
• 4.2 RNA提取和mRNA分离
• 4.2.1 RNA提取的试剂
• 4.2.2 RNA提取的步骤
• 4.2.3 mRNA分离
• 4.3 差减cDNA文库构建
• 4.3.1 抑制差减杂交
• 4.3.1.1 双链cDNA合成与RsaI酶切
• 4.3.1.2 接头连接
• 4.3.1.3 差减杂交
• 4.3.1.4 两次PCR选择性扩增
• 4.3.2 差减效率检测
• 4.3.3 差减文库生成
• 4.3.4 反向Northern筛选
• 4.3.5 Real time RT-PCR分析
• 4.3.6 生物信息学分析
• 4.4 结果分析
• 4.4.1 果实RNA提取方法的改进
• 4.4.2 差减文库构建
• 4.4.2.1 mRNA质量检测
• 4.4.2.2 cDNA合成与酶切
• 4.4.2.3 接头连接及连接效率检测
• 4.4.2.4 文库插入片段的检测
• 4.4.2.5 差减效率检测
• 4.4.2.6 差减产物克隆
• 4.4.3 反向Northern筛选
• 4.4.3.1 RNA质量检测
• 4.4.3.2 杂交筛选
• 4.4.4 序列EST分析,功能分类
• 4.4.4.1 序列EST分析
• 4.4.4.2 粒化突变体果实性状形成过程中涉及的代谢途径
• 4.4.4.3 一些候选基因的Real-time验证
• 4.5 讨论
• 参考文献
• 附录Ⅰ Real-time PCR测定基因相对表达所用引物
• 附录Ⅱ Real-time PCR测定基因相对表达Protocol
• 附录Ⅲ 粒化突变体与对照‘朋娜脐橙'果实发育过程中的差异克隆
• 附录Ⅳ 与粒化突变体果实性状形成相关的代谢途径
• 附录Ⅴ 博士期间发表的论文及投稿论文
• 致谢