猪葡萄球菌ExhB基因的原核表达及其感染裸鼠和Balb/c小鼠模型的研究

论文摘要

猪葡萄球菌（Staphylococcus hyicus, S.hyicus）是小猪全身性渗出性皮炎（Exudative epidermit, EE）的病原,随着养殖集约化程度的增强和早期断奶技术的采用,小猪全身性渗出性皮炎对养猪业所带来的负面影响也将日益明显。该病原的不同毒株可以产生不同的毒素,被命名为ExhA、ExhB、ExhC、ExhD四种,现已证实不同毒株产生的毒素是引起仔猪发病的主要因素。本文主要对可以产生B型毒素的猪葡萄球菌菌株进行研究。本病的感染动物模型多选用SPF猪。鉴于小鼠在作为动物模型方面有着简便,经济,易于操作等明显的优势,且该病在小鼠身上的研究国内外尚鲜见报道。因此,本研究选用裸鼠及Balb/c小鼠作为实验动物;对分离鉴定的猪葡萄球菌ExhB基因进行克隆表达,对所表达蛋白的致病性进行鉴定。并将该分离菌经肌肉注射裸鼠和Balb/c小鼠,探讨裸鼠和Balb/c小鼠对猪葡萄球菌的易感性及猪葡萄球菌对裸鼠和Balb/c小鼠的致病性。根据GeneBank中收录的Staphylococcus hyicus ExhB基因（序列号:AF515454等）的核苷酸序列,设计一对特异性引物P1, P2。对已经过生化鉴定的猪葡萄球菌基因组进行PCR扩增,获得大小为1280bp的基因片段,将其克隆到pMD18-T载体,获得重组质粒pMD-ExhB。用带有KpnⅠ、HindⅢ酶切位点的引物P1’,P2’,以重组质粒pMD-ExhB为模板,扩增去掉N端疏水性AA的ExhB基因。用相同的限制性内切酶酶切该PCR产物和表达载体pET-32a后构建重组表达载体pET-ExhB,转化宿主菌BL21（DE3）,经酶切及PCR鉴定筛选出阳性克隆,测序证明目的基因以正确的阅读框插入了表达载体,用不同浓度的IPTG诱导表达ExhB蛋白主要抗原区基因,收集菌液进行SDS-PAGE电泳,原核表达产物大小约为45Ku。通过ELISA和琼脂扩散实验表明,所表达的包涵体蛋白可以与用菌体制得的多克隆抗血清发生特异性结合;用复性蛋白在裸鼠身上攻毒后可以产生皮炎病变。用分离鉴定的猪葡萄球菌菌体、上清以及二者的混合物经肌肉注射裸鼠和Balb/c小鼠,通过眼观、剖检和做病理组织学切片确定其感染的状况,结果发现裸鼠和Balb/c小鼠均可被感染,分别产生不同程度的相似的临床症状。裸鼠在感染后的二到三天背部和面部皮肤上开始出现大量小的红色囊泡,四到五天后部分囊泡消失,部分形成结痂。一些裸鼠眼睛还会有较多的脓性分泌物渗出.感染两周后相继死亡。Balb/c小鼠感染该菌后多表现急性临床症状,感染后二到三天就相继死亡,因此表现不出明显的眼观病变。只有很少一部分小鼠皮肤上会出现炎性渗出,导致该处皮肤脱落。剖检发现小鼠肾脏明显肿大,肝脏充血明显。病理切片发现感染小鼠表皮角质脱落明显,棘细胞层增生,称为“棘皮症”,这是猪感染该菌后所产生的特征性症状。心、肝、肺等组织部位的细胞也都有不同称度的肿胀、变性、坏死。研究表明,Balb/c小鼠比裸鼠对猪葡萄球菌更易感,裸鼠感染后有清晰的肉眼可见的临床症状产生,而Balb/c小鼠在感染后往往还来不及表现明显的临床症状就相继死亡;用菌液和上清以及两者的混合物均可导致动物产生不同程度的病变,而上清以及复性蛋白对实验小鼠的致病性进一步证实了在该病中细菌所产生的表皮脱落毒素是引起发病的重要因素。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 综述部分
• 第一章 渗出性皮炎及猪葡萄球菌的研究进展
• 1.1 渗出性皮炎的研究历史和危害
• 1.2 猪葡萄球菌的病原学特征
• 1.3 渗出性皮炎发病机理的研究
• 1.4 EE 感染的临床症状与病变
• 1.4.1 EE 感染的临床症状
• 1.4.2 EE 的病理变化
• 1.5 诊断
• 1.5.1 鉴别诊断
• 1.6 EE 的防治措施
• 1.6.1 抗生素在治疗EE 方面的研究进展
• 1.6.2 目前的防治措施
• 第二章 猪葡萄球菌感染动物的研究进展
• 2.1 猪葡萄球菌感染猪的研究
• 2.1.1 猪葡萄球菌的宿主范围和传播方式
• 2.1.2 猪葡萄球菌的猪体试验
• 2.2 猪葡萄球菌感染其它动物的研究
• 2.2.1 猪葡萄球菌感染鸡的试验
• 2.2.2 猪葡萄球菌感染小鼠的试验
• 2.2.3 猪葡萄球菌感染兔的试验
• 2.3 裸鼠
• 2.4 论文设计思路及研究方法
• 2.4.1 技术路线
• 试验部分
• 第三章 广东省某猪场渗出性皮炎病原菌的分离和鉴定
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌种和质粒
• 3.1.2 主要仪器
• 3.1.3 主要药品及试剂
• 3.1.4 主要溶液配方
• 3.2 方法
• 3.2.1 引物的设计与合成
• 3.2.2 细菌的分离和鉴定
• 3.2.3 细菌基因组DNA 的提取
• 3.2.4 PCR 扩增目的基因
• 3.2.5 PCR 扩增产物的凝胶电泳
• 3.2.6 PCR 扩增产物的回收
• 3.2.7 目的片段与载体的连接
• 3.2.8 感受态细胞的制备
• 3.2.9 连接产物的转化
• 3.2.10 重组质粒的鉴定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 镜检结果
• 3.3.2 平板培养结果
• 3.3.3 生化鉴定结果
• 3.3.4 PCR 检测结果
• 3.3.5 重组质粒的序列分析
• 3.4 讨论
• 第四章 猪葡萄球菌ExhB 基因在大肠杆菌中的高效表达
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 菌种和载体
• 4.1.2 试验动物
• 4.1.3 主要仪器
• 4.1.4 主要试剂
• 4.1.5 主要溶液配方
• 4.2 方法
• 4.2.1 引物的设计与合成
• 4.2.2 PCR 扩增目的基因
• 4.2.3 PCR 产物的凝胶电泳
• 4.2.4 PCR 产物的回收
• 4.2.5 PCR 产物和载体酶切回收
• 4.2.6 目的片段与载体的连接
• 4.2.7 BL21 感受态的制备
• 4.2.8 连接产物的转化
• 4.2.9 重组质粒的鉴定
• 4.2.10 重组质粒的诱导表达
• 4.2.11 最佳诱导条件的确定
• 4.2.12 表达产物的检测
• 4.2.13 重组融合蛋白的纯化
• 4.2.14 纯化蛋白的复性
• 4.2.15 多克隆抗血清的制备
• 4.2.16 表达蛋白的致病性试验
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 PCR 扩增
• 4.3.2 重组表达载体的鉴定
• 4.3.3 多克隆抗体的鉴定
• 4.3.4 致病性试验结果
• 4.4 讨论
• 第五章 猪葡萄球菌感染裸鼠及Balb/c 小鼠模型的研究
• 5.1 材料
• 5.1.1 菌种和动物
• 5.1.2 仪器
• 5.1.3 试剂
• 5.2 方法
• 5.2.1 试验动物的感染方案
• 5.2.2 动物感染的鉴定
• 5.2.3 血清抗体的检测
• 5.2.4 实验动物组织脏器病理切片制作
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 小鼠临床症状
• 5.2.2 感染小鼠的镜检结果
• 5.2.3 PCR 检测结果
• 5.2.4 ELISA 检测结果
• 5.2.5 病理切片结果
• 5.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录 论文中应用的缩略语（Abbreviation）
• 致谢
• 作者简介