雷公藤内酯醇对人纤维肉瘤HT-1080细胞基质金属蛋白酶-9表达的影响及其机制研究

雷公藤内酯醇对人纤维肉瘤HT-1080细胞基质金属蛋白酶-9表达的影响及其机制研究

论文摘要

目的1.研究雷公藤内酯醇(TL)对人纤维肉瘤HT-1080细胞基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达的影响;2.研究TL调控MMP-9表达的意义;3.探讨TL调控MMP-9表达的机制。方法1.选择人纤维肉瘤细胞系HT-1080为研究对象,常规培养、传代,药物的3个工作浓度分别为6nM、12nM和18nM,处理时间均为72小时;2.采用MMT法检测TL对HT-1080细胞增殖能力的影响;3.用流式细胞仪检测TL致HT-1080细胞凋亡情况;4.运用RT-PCR检测TL对9个基因mRNA表达的影响,这些基因是:MMP-9和-2,基质金属蛋白酶组织抑制物(TIMP)-1、-2、-3和-4,DNA甲基转移酶(DNMT)-1、-3A和-3B;5.用明胶酶谱实验检测TL对HT-1080细胞MMP-9和-2活性的影响;6.用Transwell侵袭实验检测TL对HT-1080细胞体外侵袭能力的影响;7.用甲基化特异性PCR(MSP)检测TL对MMP-9基因甲基化水平的影响;8.用Western blotting检测TL对DNMT-1、-3A和-3B蛋白表达的影响。结果1.TL作用72小时,随药物浓度的增加,HT-1080细胞的增殖逐渐受到抑制;其中,半数抑制浓度约为25nM;2.浓度分别为6 nM、12 nM和18 nM的TL处理72小时后,HT-1080细胞的凋亡率分别为16.0%、17.3%和18.8%,对照组凋亡率为17.7%;3.18 nM TL处理HT-1080细胞72小时后,MMP-9 mRNA的表达明显下调(P<0.05),但MMP-2、TIMP-1/-2/-3/-4 mRNA的表达无明显变化(P均>0.05);6 nM和12 nM TL处理组上述基因的mRNA表达均无明显变化(P均>0.05);4.12 nM TL处理HT-1080细胞72小时后,在细胞无血清培养基上清中检测到的MMP-9的活性明显下调(P<0.05),18 nM TL处理组无血清培养基上清中则基本检测不到MMP-9(P<0.01);3个药物处理组MMP-2的活性均无明显变化(P均>0.05);5.Transwell侵袭实验发现,18nM TL处理72小时后,穿过人工基底膜的细胞数明显减少,约相当于对照组的65%(P<0.05);抗MMP-9单克隆抗体处理组穿过人工基底膜的细胞数亦明显减少,约相当于对照组的50%(P<0.05);6nM和12nM TL处理组穿过人工基底膜的细胞数均无明显变化(P均>0.05);6.18 nM TL处理HT-1080细胞72小时后,MMP-9基因甲基化水平明显上调(P<0.05);6nM和12 nM TL处理组MMP-9基因甲基化水平均无明显变化(P均>0.05);7.18 nM TL处理HT-1080细胞72小时后,DNMT-1和-3A mRNA及蛋白表达明显上调(P均<0.05),DNMT-3B mRNA及蛋白表达无明显变化(P>0.05);6nM和12nM TL处理组DNMT-1、-3A和-3BmRNA及蛋白表达均无明显变化(P均>0.05)。结论1.TL抑制HT-1080细胞的增殖;2.TL可能通过抑制MMP-9的表达及活性而抑制肿瘤细胞体外侵袭能力;3.首次证实TL上调MMP-9基因甲基化水平;4.首次证实TL上调DNMT-1和-3A的表达。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 缩略词
  • 第一部分:雷公藤内酯醇作用浓度的筛选
  • 第一章 前言
  • 第二章 材料与方法
  • 2.1 研究对象
  • 2.2 主要仪器设备及试剂
  • 2.3 实验方法
  • 第三章 结果
  • 3.1 雷公藤内酯醇对HT-1080细胞形态学的影响
  • 3.2 雷公藤内酯醇对HT-1080细胞增殖的影响
  • 3.3 雷公藤内酯醇对HT-1080细胞调亡的影响
  • 第四章 讨论
  • 第五章 结论
  • 第二部分:雷公藤内酯醇对纤维肉瘤HT-1080细胞表达基质金属蛋白酶-9的影响及其意义
  • 第一章 前言
  • 第二章 材料与方法
  • 2.1 主要仪器设备及试剂
  • 2.2 实验方法
  • 第三章 结果
  • 3.1 雷公藤内酯醇对HT-1080细胞MMP-9和-2 mRNA表达的影响
  • 3.2 雷公藤内酯醇对HT-1080细胞MMP-9和-2酶活性的影响
  • 3.3 雷公藤内酯醇对HT-1080细胞体外侵袭能力的影响
  • 第四章 讨论
  • 第五章 结论
  • 第三部分:雷公藤内酯醇抑制人纤维肉瘤HT-1080细胞表达基质金属蛋白酶-9的机制探讨:对DNA基化的影响
  • 第一章 前言
  • 第二章 材料与方法
  • 2.1 主要仪器设备及试剂
  • 2.2 实验方法
  • 第三章 结果
  • 3.1 雷公藤内酯醇对HT-1080细胞TIMPs mRNA表达的影响
  • 3.2 雷公藤内酯醇对HT-1080细胞MMP-9基因甲基化水平的影响
  • 3.3 雷公藤内酯醇对HT-1080细胞DNMTs mRNA表达的影响
  • 3.4 雷公藤内酯醇对HT-1080细胞DNMTs蛋白表达的影响
  • 第四章 讨论
  • 第五章 结论
  • 参考文献
  • 综述一
  • 综述二
  • 致谢
  • 攻读学位期间主要的研究成果
  • 相关论文文献

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