论文摘要
研究背景和目的Gankyrin是2000年日本科学家Fujita等人应用消减杂交法从人肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）组织高表达的基因中筛选出的一条编码重复ankyrin（ANK）序列的新基因。我们检索基因库后发现ggnkyrin与1998年Hori等人发现的p28（Nas6p）基因序列完全一致,遂将其命名为p28GANK。癌基因p28GANK编码的蛋白是人26S蛋白酶体（26S proteasome）调节亚单位19S/PA700复合物的一种非ATP酶亚基,其核酸序列中含有5个串联排列的ANK重复单何,其保守的ankyrin序列介导蛋白与蛋白间的相互作用。26S蛋白酶体中的20S蛋白小体是降解体内某些错误折叠蛋白或细胞周期蛋白的场所,目前尚不清楚癌蛋白p28GANK在26S蛋白酶体降解蛋白过程中的具体分子作用机制。前期研究发现癌蛋白p28GANK通过与Rb的直接相互作用,调节Rb的磷酸化程度,此外,P28GANK与pRb结合后还可能通过26S蛋白酶体的S6bATP酶促进pRb的降解;或pRb直接与26S蛋白酶体的20S核结合而介导其自身降解。通过以上多种途径P28GANK调控CDK4/CyclinD1/p16INK4a/Rb1/E2F-1信号传导通路,已知该信号转导通路在肝癌的发生发展过程中具有相当重要的作用。因此,针对该通路及相关靶点采取干预措施有望成为肝癌治疗的新途径。本论文主要针对CDK4/CyclinD1/p16INK4a/Rb1/E2F-1信号转导通路中P28GANK和Rb的相互作用的关键区域和氨基酸,运用计算机辅助药物设计程序设计特异性阻断两者结合的小分子化合物并对其进行生物学功能鉴定。计算机辅助药物设计（CADD）涉及化学、生物学、计算机科学、信息学、数学和物理学等领域,是一门新兴的、快速发展的边缘学科。它基于药物及其生物大分子靶标的知识,通过理论模拟和计算来预测受体与配体间的相互作用,从而指导和辅助药物设计,加快药物开发进程。随着药物设计理论和方法的不断发展和完善,CADD在药物先导化合物发现和开发的过程中起到了日益重要的作用,目前已有不少成功的例子。因此,CADD已被公认为是一种高效的药物设计手段。前期研究显示P28GANK主要通过N末端的LxCxE模序与pRb的C端产生特异相互作用,在这段序列进行的突变实验证实其能影响P28GANK与Rb的结合,而含有LxCxE的多肽也能阻断P28GANK与Rb的作用,因此推测此处即为P28GANK与Rb的作用部位。p28GANK的表面没有合适的口袋或活性位点,而在Rb上与含有LxCxE模序多肽特异结合的部位有一个位处表面的口袋可用于先导化合物的设计筛选。所以我们选择Rb作为药物筛选的靶标,希望能够找到特异性阻断P28GANK和Rb结合的小分子化合物。实验方法1、运用生物信息学的方法在互联网上寻找Rb的晶体结构,确定与P28GANK相互作用的空间结构及关键氨基酸残基,并设计虚拟筛选流程;2、综合考虑分子量、疏水性、氢键受体、氢键供体、柔性键和环比度等各方面对含有约26万个小分子的SPECS200603化合物库进行类药性过滤;3、将符合药性规则的分子用DOCK4.0和Glide对接,各取得分排名靠前的10000个化合物,综合两者打分最好的1286个化合物;4、用Autodock3.05进行对接,选取前500个化合物,根据关键结合位点信息直接观察挑选;5、经综合评价,选择100个化合物购买,并最终获得71个化合物;6、构建p28GANK-GST融合质粒,在BL21大肠杆菌中诱导表达并纯化GST和GST-P28GANK蛋白;7、构建Rb野生型和针对LxCxE与Rb结合口袋关键位点的突变体的真核表达质粒;8、各Rb突变体质粒瞬转293T细胞,并用GST-pulldown验证这些位点在Rb和p28GANK结合中的关键性;9、运用CCK-8的方法按不同的浓度梯度初筛有活性的小分子化合物;10、对生物学活性比较好的化合物细化浓度梯度,检测其在不同的肝癌细胞系和正常细胞系中对细胞增殖的影响;11、运用GST-pulldown方法验证化合物能否抑制Rb与P28GANK的结合。结果1、通过药物设计程序确定Rb蛋白与P28GANK相互作用的结构域（口袋）和关键氨基酸;运用Rb蛋白的突变体作GST-pulldown,证实构成与p28GANKLxCxE序列结合口袋的709、713、753、756、757、761位点的突变能够有效抑制Rb与P28GANK的结合,其中,709和713位点尤为关键。2、利用CADD虚拟筛选出大约100个小分子化合物,实际购买获得71个。3、利用CCK-8初步筛选出6号小分子化合物能有效地抑制肝癌细胞的增殖且对正常细胞基本无影响,其EC50为3um,对稳定表达P28GANK的NIH/3T3-p28GANK细胞系有明确的抑制增殖活性,而对NIH/3T3-pcDNA3.1细胞系无作用。4、通过GST-pulldown方法证实6号化合物能有效抑制Rb与P28GANK结合。结论本研究首次针对肝癌癌基因p28GANK的信号转导机制,以Rb与相互作用的空间区域及关键氨基酸为靶点,运用计算机辅助药物设计的方法进行小分子抑制剂的设计分析。已筛选出一个有特异生物学活性的小分子化合物,该小分子能阻断Rb与P28GANK的结合,并抑制肝癌绌胞的增殖。
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标签：肝细胞性肝癌论文; 小分子抑制剂论文; 蛋白相互作用论文; 计算机辅助药物设计论文;