口蹄疫病毒组合基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达及差异分析

论文摘要

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起猪、牛、羊等偶蹄动物的一种烈性传染病,严重危害畜牧业生产,对国民经济造成巨大的经济损失。目前传统疫苗在FMD预防控制中仍占主导地位,但因生产成本昂贵、疫苗制备过程中病毒逃逸等潜在危险难以避免等因素,急需研制一种安全、高效的FMD分子疫苗。本研究利用家蚕/杆状病毒表达系统进行了O型FMDV组合基因的表达及AsiaⅠ型FMDV组合基因在不同家蚕品种中的表达差异分析,为利用家蚕生物反应器生产FMD分子疫苗提供参考依据。（1）选用OMⅢ株FMDV衣壳蛋白前体P1、非结构蛋白2A、3C,将其插入家蚕杆状病毒转移载体pVL1393中,构建重组质粒pVL-P12A3C,与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,获得重组病毒Bm-P12A3C。通过免疫荧光技术证明重组病毒能够正确表达插入的外源基因。将共转染后的重组病毒感染家蚕5龄幼虫,双抗体夹心ELISA法测定目的蛋白在家蚕血淋巴中获得了表达。对重组病毒进行筛选和纯化,将筛选后的重组病毒继续感染家蚕5龄起幼虫,用相同的方法进行检测,结果表明FMDV抗原在家蚕中获得了较高的表达。（2）选用了20个品种的家蚕蚕蛹,注射可以高效稳定表达FMDV AsiaⅠ型P1-2A3C基因的重组病毒,通过双抗体夹心ELISA方法检测目的蛋白在蚕蛹中的表达情况,并进行了差异分析。结果表明目的蛋白在各品种家蚕中的表达量存在一定差异,其中以9、10、12、14、15、17号等品种表达量相对较高。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略表
• 第一章 文献综述
• 1 FMDV分子生物学特性研究进展
• 1.1 FMDV基因组结构特点
• 1.2 FMDV 5'非翻译区（5'-UTR）
• 1.2.1 蛋白质帽状结构（cap）
• 1.2.2 FMDV S 片段、poly（C）区、假结（PKs）和顺式复制元件（cre）
• 1.2.3 FMDV内部核糖体进入位点（IRES）
• 1.2.4 FMDV L区
• 1.3 FMDV结构蛋白和非结构蛋白
• 1.3.1 FMDV结构蛋白
• 1.3.2 FMDV非结构蛋白
• 1.3.2.1 FMDV 2A/B/C
• 1.3.2.2 FMDV 3A/B
• 1.3.2.3 FMDV 3C蛋白酶（3Cpro）
• 1.3.2.4 FMDV 3D聚合酶（3Dpol）
• 1.3.3 FMDV 3'非翻译区
• 2 口蹄疫的流行
• 3 口蹄疫病疫苗研究进展
• 4 家蚕杆状病毒表达系统的研究进展
• 4.1 杆状病毒表达系统的生物学特点
• 4.2 家蚕杆状病毒（BmNPV）表达系统的特点
• 4.2.1 BmNPV作为载体的特点
• 4.2.2 家蚕杆状病毒表达系统的原理
• 4.2.3 家蚕/BmNPV表达系统的优点及优化表达的策略
• 4.2.3.1 家蚕/BmNPV表达系统的优点
• 4.2.3.2 家蚕生物反应器优化表达的策略
• 4.2.4 家蚕/BmNPV表达系统在基因工程疫苗生产中的应用
• 4.2.4.1 高水平表达抗原蛋白
• 4.2.4.2 表达产物活性高
• 5 总结
• 第二章 O型口蹄疫病毒组合基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 病毒RNA的提取
• 1.3 重组杆状病毒转移载体的构建
• 1.3.1 目的基因的扩增
• 1.3.2 PCR产物的纯化、回收
• 1.3.3 PCR纯化产物与pMD18-T载体连接
• 1.3.4 转化感受态细胞
• 1.3.5 质粒DNA的提取
• 1.3.6 重组质粒的鉴定
• 1.3.7 目的片段与pVL-1393载体的连接
• 1.4 构建、筛选携带P1-2A与3C基因的重组杆状病毒
• 1.4.1 BraN细胞的复苏、传代及病毒繁殖
• 1.4.2 离心法制备病毒Bm-BacPAK6基因组DNA
• 1.4.3 Bm-BacPAK6基因组DNA的线性化
• 1.4.4 共转染
• 1.4.5 共转染的重组病毒蚕体表达结果
• 1.4.6 病毒的筛选、纯化和扩增
• 1.4.7 重组病毒的鉴定
• 1.5 P1-2A、3C基因在Bm-N细胞内表达
• 1.6 P1-2A、3C基因在家蚕中的表达
• 1.7 筛选高表达克隆毒株
• 1.8 表达时相测定
• 2 结果
• 2.1 重组杆状病毒转移载体（pVL-P12A3C）的构建
• 2.2 P12A3C在Bm-N细胞中表达结果
• 2.3 P12A3C在蚕体中的表达结果
• 2.4 筛选高表达克隆毒株
• 2.5 表达时相测定
• 3 讨论
• 第三章 AsiaI型口蹄疫病毒组合基因在各种系家蚕蚕体内表达差异分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 全文结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简历
• 导师简介