DNA甲基化抑制剂5-Azacytidine对猪LLC-PK1细胞GDF11表达的影响及猪GDF11的原核表达

论文摘要

生长分化因子11（GDF11）是转化生长因子β（TGF-β）超家族中的一种分泌型信号分子,又称为骨形态发生蛋白11（BMP11）。从1999年发现至今,对GDF11的研究主要集中于其在早期胚胎发育中的调控作用,特别是在中轴骨骼的图式形成以及肾发生中的作用。体长是猪育种中的一个重要的经济性状,其长短与胸腰椎数密切相关。因此,研究DNA去甲基化对猪GDF11表达的影响,对于了解猪体长变异的表观遗传机制,具有重要科学意义和潜在的应用价值。本研究可以分为两个部分:第一部分:用DNA甲基化抑制剂5-azaC处理猪肾近端小管上皮细胞系LLC-PK1,提取细胞总RNA,运用RT-PCR和半定量PCR的方法分析不同的处理浓度和处理时间对猪GDF11表达的影响。结果表明:处理24h后0.5、1和3μM 5-azaC处理组之间GDF11的相对表达量差异显著（P<0.05）;处理48h后差异不显著;处理72h后,0.05、0.1、0.3、0.5、1和3μM 5-azaC处理组之间差异显著（P<0.05）。在每个处理浓度下,处理24、48和72h后GDF11的相对表达量差异极显著（P<0.01）。第二部分:根据GenBank公布的猪GDF11序列设计引物,利用来自6.5cm猪胚肾cDNA作为模板,通过PCR的方法克隆编码猪GDF11蛋白羧基末端327个氨基酸的cDNA序列,将此序列连接入原核表达载体pGEX-6p-1中,测序验证表明重组质粒pGEX-6p-1-GDF11构建成功。将重组的表达质粒pGEX-6p-1-GDF11转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,使用IPTG诱导目的蛋白的表达,经SDS-PAGE验证表明,融合蛋白GST-GDF11在大肠杆菌中得到成功表达。利用电洗脱的方法对GST-GDF11融合蛋白进行初步纯化,SDS-PAGE结果表明,得到纯度较高的融合蛋白GST-GDF11。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 文献综述
• 1. GDF11 的研究现状
• 1.1 GDF11 的发现
• 1.2 GDF11 的结构，同源性分析及染色体定位
• 1.3 GDF11 的功能研究
• 1.4 GDF11 在整个胚体和各个组织器官发育中的表达情况
• 1.5 GDF11 的信号传导通路
• 1.6 GDF11 的表达调控
• 2. DNA 甲基化的研究概况
• 2.1 表观遗传学发展简史及其概述
• 2.2 哺乳动物DNA 甲基化的研究概况
• 2.3 哺乳动物DNA 甲基化的研究方法
• 2.4 DNA甲基化抑制剂5-azaC和5-aza-dC在表观遗传学研究中的应用
• 3. 本研究的目的与意义
• 第一部分 DNA甲基化抑制剂5-azaC对猪LLC-PK1细胞 GDF11表达的影响
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2. 结果
• 2.1 LLC-PK1 细胞的生长行为及形态观察
• 2.2 5-azaC 处理后细胞的生长行为及形态观察
• 2.3 总RNA 的提取与检测
• 2.4 猪GDF11 表达的半定量PCR 分析
• 3. 讨论
• 第二部分 猪GDF11 蛋白羧基末端多肽在大肠杆菌内的表达及表达产物的初步纯化
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2. 结果
• 2.1 表达质粒pGEX-6p-1-GDF11 构建及鉴定
• 2.2 PCR 引物的位置及扩增序列
• 2.3 猪GDF11 部分编码区序列的PCR 扩增
• 2.4 表达质粒pGEX-6p-1-GDF11 的酶切鉴定
• 2.5 表达质粒pGEX-6p-1-GDF11 的测序鉴定
• 2.6 GST-GDF11 融合蛋白的表达
• 2.7 GST-GDF11 融合蛋白的初步纯化
• 2.8 GST-GDF11 融合蛋白浓度测定
• 3. 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 在读期间发表论文情况