雌二醇上调人DNA错配修复基因hMLH1作用机制的初步研究

论文摘要

研究背景及目的人DNA错配修复（mismatch repair, MMR）系统在维持基因组稳定性中起着关键作用。MMR功能障碍导致的微卫星不稳定（microsatellite instability,MSI）与许多恶性肿瘤的发生有密切关系。大部分遗传性非息肉病性结直肠癌（hereditary nonpolyposis colorectal cancer, HNPCC）由MMR基因种系突变引起。此外，一部分散发性结直肠癌也与MMR功能障碍相关。hMLH1是体内最重要的MMR基因之一。前期研究发现，正常人血清雌激素（Estradiol，E2）水平与结肠上皮细胞中hMLH1基因表达水平呈正相关。细胞实验证实，E2能上调结肠癌细胞株COLO205的hMLH1基因表达量，并且这种上调作用很可能发生在转录水平。然而，E2如何调节错配修复基因hMLH1表达的具体机制尚不清楚。本研究旨在构建含hMLH1启动子片段的荧光素酶报告基因载体，检测其在HEK293和LoVo细胞株中E2诱导下的转录活性。研究方法1、根据UCSC（www.geome.ucsc.edu）数据库确定hMLH1基因转录起始位点，用PCR方法克隆hMLH1启动子序列（-1953/+53），定向插入到双荧光报告基因载体pGL3-Basic，抽提质粒并经双酶切和测序鉴定。构建好的含hMLH1启动子的真核表达质粒命名为pGL3-Promoter-luc。2、用瞬时转染的方法将pGL3-Promoter-luc、阴性对照（pGL3-Basic）和阳性对照（pGL3-Control）分别与内参质粒（pRL-SV40）共转入HEK293和LoVo细胞。检测不同作用时间和不同剂量的E2对报告基因荧光素酶活性值的影响，以及E2-BSA和ICI182.780对hMLH1启动子转录活性的影响。3、运用Western Blot法检测HEK293和LoVo细胞中hMLH1的相对表达量。结果1、构建的含hMLH1启动子的重组质粒经酶切和测序鉴定,插入的核苷酸序列与UCSC数据库中hMLH1启动子区序列完全吻合，说明报告基因重组质粒构建成功。2、报告基因荧光素酶活性对E2存在一定的剂量依赖和时间依赖关系。10-9mol/L的E2处理24小时后，报告基因荧光素酶活性值增强最明显（n=3，P<0.01），而这种效应能被雌激素受体拮抗剂ICI182.780抑制。E2-BSA对目的基因的上调作用不如E2显著。3、运用Western Blot检测HEK293和LoVo细胞株内源性hMLH1基因蛋白表达量，转染pRST7-ERβ组高于对照组（n=3，P<0.01）。结论E2能上调HEK293和LoVo细胞错配修复基因MLH1的表达，并能显著增强由hMLH1启动子序列引导的荧光素酶表达活性，说明hMLH1启动子序列中存在与E2相关的调控序列，且ERβ在此过程中起到重要作用。该报告基因载体为进一步明确参与调控的顺式作用元件和转录因子奠定了实验基础。

论文目录

• 英文缩写一览表
• Abstract
• 摘要
• 前言
• 实验材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 全文结论
• 致谢
• 参考文献
• 文献综述 雌激素对 DNA 错配修复基因转录调控作用
• 参考文献
• 在读期间发表的文章