RNAi沉默survivin基因对TCCB的影响及其机制的研究

论文摘要

目的筛选和鉴定重组表达质粒pshRNA-survivin。方法重新克隆pshRNA-survivin重组质粒后,Amp筛选阳性克隆提取质粒DNA,用Sal I、EcoR I和Hind III分别酶切阳性克隆,并用相同的条件酶切载体pTZU6+1作为对照,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定;将筛选的阳性克隆质粒进行序列分析。结果经EcoR I和Hind III双酶切和序列分析证实阳性克隆中含有和设计片段完全一致的序列,插入DNA片段为:TCGAGCTGAGAACGAGCCAGACTTGTTAGTACTCAAGTCTGGCTCGTTCTCAGTTTTT（SUR-siRNA suqunce）,所得测序结果与GeneBank文献报道的一致,未见缺失和突变,表明成功筛选和鉴定了含目的DNA片段的重组质粒pshRNA-survivin。结论重组质粒pshRNA-survivin筛选和鉴定成功,可用于后续实验。目的观察重组质粒pshRNA-survivin对TCCB细胞株T24细胞中survivin基因和蛋白表达的抑制作用。方法将pshRNA-survivin质粒转染TCCB细胞株T24细胞,采用RT-PCR和Western blot检测T24细胞内survivin基因和蛋白的表达。结果pshRNA-survivin转染T24细胞后,能明显抑制survivin基因和蛋白的表达,应用Quantity One软件分析结果,survivin mRNA表达抑制率达61.73%,survivin蛋白表达抑制率达53.37%。结论pshRNA-survivin能够抑制T24细胞survivin基因和蛋白的表达。目的观察pshRNA-survivin对T24细胞的生物学行为的影响。方法pshRNA-survivin质粒转染TCCB细胞株T24细胞,MTT法观察pshRNA-survivin对细胞的增殖抑制作用;细胞运动实验、细胞侵袭实验检测psh-survivin对T24细胞的生长、运动、侵袭的抑制作用;流式细胞仪和AO/EB荧光染色法检测T24细胞的凋亡;透射电镜观察T24细胞超微结构变化。结果MTT结果显示,转染组在24h、48h、72h时肿瘤抑制率分别为15.69%、27.64%和59.13%,细胞增殖受到抑制;流式细胞结果表明pshRNA-survivin组的细胞凋亡率为（16.76±1.31）%,与未转染组凋亡率（2.82±1.44）%、空载体组凋亡率（3.59±1.23）%比较有显著差异（P<0.01）;AO/EB荧光染色法测定转染24h后,未转染组凋亡率为（2.37±1.67）%,空载体组的凋亡率为（5.15±2.28）%,pshRNA-survivin组的细胞凋亡率为（14.26±2.97）%,转染组与未转染组、空载体组相比较有显著性差异（P<0.01）,转染48h后,转染组细胞死亡率（40.03±6.32）%和其他两组比较差异有显著性（P<0.01）;细胞运动实验、细胞侵袭实验表明pshRNA-survivin组的细胞侵袭力与运动能力均有显著的降低（穿膜细胞数分别为10.34±1.85、41.32±3.47）,与未转染组（27.62±2.06、62.84±4.97）和空载体组（26.07±1.73、64.15±6.71）比较有显著差异（P<0.01）;透射电镜可观察到pshRNA-survivin组发生大量T24细胞的凋亡。结论当沉默survivin基因后,T24细胞增殖受到抑制、细胞侵袭力与运动能力均有明显的下降,细胞凋亡增加,提示survivin可能是TCCB生物学治疗的一个潜在靶点。目的建立TCCB裸鼠异位肿瘤模型,观察pshRNA-survivin对TCCB生长抑制作用。方法筛选稳定表达survivin-siRNA的膀胱移行细胞癌细胞株（T24/survivin-siRNA）;实验共分3组:pshRNA-survivin转染组、空载体组、未转染组（每组5只）;建立裸鼠皮下种植瘤模型,观察肿瘤形成时间,计算抑瘤率;HE染色行组织学检查;免疫组化检测survivin蛋白表达。结果pshRNA-survivin组种植瘤形成的时间显著地延长,与其它两组比较有显著性差异（P<0.01）;在14d、21d,pshRNA-survivin组种植瘤体积（分别为54.19±3.81、149.54±11.49）,与未转染组（138.40±12.44、311.02±37.01）和空载体组（167.15±13.15、338.24±19.62）比较有显著性差异（P<0.01）;pshRNA-survivin组21d时的抑瘤率为68.93%,与未转染组、空载体组有明显差异（P<0.01）;光镜下可见未转染组和空载体组发生肌肉侵润、肌纤维的溶解、断裂;免疫组化显示pshRNA-survivin组survivin蛋白的表达与未转染组比较有显著的降低（IOD分别为8705.4、3814932.1）。结论在TCCB裸鼠异位肿瘤模型中,pshRNA-survivin能够显著抑制移植瘤的生长、浸润和survivin蛋白的表达。

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• 英文摘要
• 论文正文：RNAi 沉默survivin 基因对TCCB 的影响及其机制的研究
• 前言
• 第一部分 pshRNA-survivin 重组质粒的筛选和鉴定
• 前言
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二部分 RNAi 沉默TCCB 细胞中survivin 基因的表达
• 前言
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三部分 沉默survivin 基因对T24 细胞生物学行为的影响
• 前言
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第四部分 RNAi 沉默survivin 基因对TCCB 裸鼠异位肿瘤生长的抑制
• 前言
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 全文结论
• 文献综述一：survivin 与基因治疗
• 文献综述二：HGF/c-Met 信号系统与前列腺癌
• 致谢
• 攻读博士学位期间研究成果及发表文章目录