银杏GbPAL和GbANS基因的克隆与表达及ALA对类黄酮含量的影响

论文摘要

银杏叶类黄酮具有重要的药用价值,提高其含量已成为银杏研究的热点与难题。研究表明,采用生理生化途径调控银杏叶类黄酮含量是一种有效的方法;利用植物基因工程技术提高银杏叶类黄酮含量也具有良好的前景。然而,银杏类黄酮生物合成途径在分子水平上的报道还较少。为深入研究银杏类黄酮的合成途径,并为今后利用基因工程技术提高银杏类黄酮含量奠定基础,本文首次克隆并研究了银杏类黄酮合成途径中的两个重要的基因,它们分别是苯丙氨酸解氨酶基因（GbPAL）和花色素合成酶基因（GbANS）。针对生理生化途径,本文研究了5-氨基乙酰丙酸（ALA）处理对银杏叶片类黄酮含量影响,以期为提高银杏叶类黄酮含量提供理论依据。其主要研究内容与结果如下:（1）银杏苯丙氨酸解氨酶基因的克隆、性质以及表达模式研究。利用RACE技术从银杏中克隆获得一个苯丙氨酸解氨酶基因GbPAL的cDNA和基因组全长（GenBank Accession No. EU071050）。GbPAL基因基因组序列与cDNA序列一样,无内含子。GbPAL基因cDNA全长为2886 bp,含有一个2172 bp的开放阅读框（ORF）,编码724个氨基酸。蛋白质同源比对分析表明,GbPAL与其它植物的PAL蛋白高度同源,且包含苯丙氨酸解氨酶所必需的保守氨基酸位点和保守模式。用同源建模的方法得到GbPAL蛋白的三维模型,这个模型与欧芹PAL（PcPAL）的三维结构高度相似。PAL基因的系统进化树分析结果表明,GbPAL与裸子植物的PAL具有更近的亲缘关系。Southern blot结果表明,GbPAL基因属于一个多基因家族。实时定量PCR（real-time PCR）分析表明,GbPAL基因在银杏不同器官中组成型表达,但在茎和叶中的表达相对较高。Real-time PCR分析结果显示,GbPAL基因的表达受UV-B、机械损伤、水杨酸和低温的诱导,暗示GbPAL基因参与了银杏对逆境胁迫的抗性。线性回归分析结果表明银杏叶类黄酮含量与GbPAL基因表达量之间存在显著正相关关系,表明GbPAL基因可能是银杏叶类黄酮合成途径中的关键基因之一。（2）银杏花色素合成酶基因的克隆、功能分析及响应非生物胁迫的表达模式。利用RACE技术首次从裸子植物银杏中克隆得到一个花色素合成酶基因GbANS的cDNA全长（EU600206）和基因组序列（EU600205）。GbANS基因全长cDNA为1441 bp,含有一个1062 bp的ORF,编码354个氨基酸。蛋白序列多重比对结果表明,GbANS蛋白与其它植物的ANS蛋白具有很高的相似性,GbANS存在结合亚铁离子和酮戊二酸的保守位点。GbANS基因含有三个外显子和两个内含子。通过基因组步移的方法获得了GbANS基因的5’侧翼序列,该区域含有包括TATA盒在内的启动子必需元件,序列预测表明,这个区域还含有光、冷、水杨酸、乙烯和脱落酸应答等顺式作用元件。同源建模产生的GbANS三维结构与功能已知的、拟南芥ANS（AtANS）的三维结构一样,具有2-ODD酶特征性的扭曲果冻状结构。类黄酮特异2-ODD酶进化树分析表明,GbANS与其它植物的ANS具有共同的祖先。Southern blot结果显示,GbANS基因属于一个多基因家族。Real-time PCR分析表明,GbANS基因的表达水平在不同器官以及器官不同时期均有差异性,在成熟果中的表达量最高,胚珠和雄蕊,茎和根中未检测到有表达,花青苷在各器官中的含量显示了与GbANS基因器官与发育表达图谱良好的一致性。real-time PCR分析结果显示GbANS基因的表达水平受UV-B、脱落酸、低温、水杨酸、乙烯以及蔗糖上调,这一结果与GbANS基因启动子序列预测分析的结果相吻合,表明GbANS基因可能参与银杏对上述逆境胁迫下的抗性。原核表达的重组GbANS蛋白的分子量大小和通过生物信息学预测的分子量大小相同。Western blot试验结果表明,重组GbANS蛋白的N末端含有6×His标签,说明GbANS基因编码的GbANS蛋白可以在大肠杆菌中正确的表达。利用HPLC分析纯化的重组GbANS蛋白体外酶活性,结果表明重组GbANS蛋白具有两种功能,即（1）催化无色花青素生成花青素,（2）催化二氢槲皮素生成槲皮素。（3） ALA对银杏类黄酮含量的影响。以3年生盆栽银杏实生苗为试材,研究了叶面处理浓度分别为10、100 mg/L的ALA对银杏叶光合作用、叶绿素含量、可溶性糖含量、类黄酮含量、总多酚含量、花青苷、黄酮合成相关的酶（PAL、CHS和CHI）活性的影响。结果表明,在处理后的第4天,相对对照而言,ALA处理的银杏叶的光合速率显著提高,ALA的这种促进作用一直稳定维持到处理后的第16天。ALA处理能显著提高银杏叶的叶绿体和可溶性糖含量,且随着处理时间的延长增幅加大,但对于叶绿体a/叶绿体b的比值无显著性差异。总酚、类黄酮以及花青苷含量在ALA的处理下迅速增加,其增加速率显著高于对照。ALA处理下PAL、CHS和CHI的活性变化与类黄酮含量的变化趋势相似,表明ALA可显著诱导PAL、CHS和CHI的活性。上述处理效果均具有浓度效应,以100mg/L ALA的效果较佳。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1 课题的提出
• 2 银杏叶类黄酮研究进展
• 2.1 银杏叶类黄酮的合成
• 2.2 调节银杏叶类黄酮合成代谢的因子
• 2.3 银杏叶类黄酮合成代谢的遗传和生理生化机理
• 3 本课题研究的内容、目的及意义
• 第二章 银杏苯丙氨酸解氨酶基因的克隆、性质以及表达模式研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 GbPAL 的全长cDNA 序列的克隆和特征分析
• 2.2 GbPAL 的基因组序列的克隆及其特征分析
• 2.3 GbPAL 蛋白质的特征分析
• 2.4 GbPAL 蛋白的三维模型分析
• 2.5 GbPAL 基因的系统进化树分析
• 2.6 GbPAL 基因的Southern blot 分析
• 2.7 GbPAL 基因的表达分析
• 2.8 银杏叶生长过程中类黄酮积累以及PAL 活性、GbPAL 基因表达水平之间的关系
• 3 讨论
• 3.1 GbPAL 基因的克隆及性质分析
• 3.2 GbPAL 基因的表达模式
• 3.3 GbPAL 基因表达量与黄酮的积累
• 4 小结
• 第三章 银杏花色素合成酶基因的克隆、功能分析以及响应非生物胁迫的表达模式
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 GbANS 基因全长cDNA 的克隆及其特征分析
• 2.2 GbANS 的基因组序列的克隆及其特征分析
• 2.3 GbANS 的基因5'侧翼序列分析
• 2.4 GbANS 蛋白质的特征分析
• 2.5 GbANS 蛋白质的三维模型分析
• 2.6 GbANS 基因的系统进化树分析
• 2.7 GbANS 基因的Southern blot 分析
• 2.8 GbANS 基因的组织特异性表达及对应器官的花青苷含量分析
• 2.9 GbANS 基因在紫外、低温、水杨酸、脱落酸、乙烯利和蔗糖处理下的表达模式
• 2.10 GbANS 重组蛋白的原核表达、纯化及Western blot 分析
• 2.11 GbANS 重组蛋白体外酶活性分析
• 3 讨论
• 3.1 GbANS 基因克隆及性质
• 3.2 GbANS 基因的组织特异性表达模式
• 3.3 GbANS 基因的响应逆境胁迫的表达模式
• 3.4 GbANS 重组蛋白的功能分析
• 4 小结
• 第四章 5-氨基乙酰丙酸对银杏叶类黄酮含量的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料及处理
• 1.2 测定方法
• 1.3 数据分析
• 2 结果与分析
• 2.1 ALA 对银杏叶光合速率的影响
• 2.2 ALA 对银杏叶绿体含量的影响
• 2.3 ALA 对银杏叶可溶性糖含量的影响
• 2.4 ALA 对银杏叶总酚、类黄酮和花青苷积累的影响
• 2.5 ALA 对银杏叶PAL、CHS 和CHI 活性的影响
• 3 讨论
• 3.1 ALA 对银杏叶片光合速率和叶绿体含量的影响
• 3.2 ALA 对银杏叶可溶性糖含量的影响
• 3.3 ALA 提高银杏叶总酚、类黄酮和花青苷含量生理机制
• 4 小结
• 第五章 结论及创新点
• 1 GBPAL 基因的克隆与表达分析
• 2 GBANS 基因的克隆、表达与功能分析
• 3 ALA 对银杏叶类黄酮含量的影响
• 4 下一步研究设想
• 5 本文创新点
• 参考文献
• 博士期间发表和整理论文情况
• 致谢