论文摘要
龋病是危害人类口腔健康的细菌感染性疾病。在我国该病患病率不仅高,且呈上升趋势,因此如何有效地预测和预防该病的发生是我国龋病防治工作的重要课题之一。然而,目前尚无准确有效的龋病预测方法,传统的方法主要是通过检测口内主要致龋菌—血清C型变形链球菌（Streptococcus rnutans,简称S.mutans,变链菌）的数量来预测个体发生龋病的风险。该法在预测中具有局限性,且人们通过研究证实在致龋过程中变链菌数量并不是唯一的决定因素,菌株间致龋性存在的差异也是重要的影响因素,因此,研究变链菌菌株间致龋性差异将为我们对龋病预测提供新的思路。为研究变链菌菌株间致龋性的差异及其原因,本课题组前期已自高龋患者和无龋健康人口内分离获得血清C型变链菌临床株593号菌株和18号菌株,并经过体外致龋实验证实了两菌株致龋能力确实存在差异。本研究以前期研究成果为基础,采用最新的蛋白组学技术进一步分析两菌株间蛋白表达的差异,以期深入探讨两菌株间致龋性存在差异的原因。本研究包括两部分实验:第一部分:高龋患者与无龋健康人口内血清C型变形链球菌分离株总体蛋白表达差异的SDS-PAGE分析方法:采用超声法和沉淀法提取两菌株在中性条件下的菌体和菌外可溶性蛋白,并进行蛋白组学差异十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis ,SDS-PAGE）分析。结果:菌体蛋白电泳图中可见593号菌株在75 KDa左右存在特异条带,且二者在85,60,50,40KDa左右蛋白表达量上存在差异。菌外分泌蛋白电泳图中可见593号菌株在75,40KDa左右有特异条带,二者在60KDa左右蛋白表达量上存在差异。结论:两菌株在中性条件下总体蛋白的蛋白表达存在明显差异,这些差异可能与两菌株间的致龋能力存在差异有关。第二部分:在不同pH条件下高龋患者与无龋健康人口内血清C型变形链球菌分离株表面相关蛋白表达差异的分析方法:采用Homer法提取两菌株在pH7.0和pH5.0条件下的膜表面相关蛋白,并进行SDS-PAGE、二维凝胶电泳（Two-dimensional gel electrophoretic,2-DE）及基质辅助激光解吸电离飞行时间（matrix-assisted laser desorption ionization time of flight ,MALDI-TOF）质谱（mass spectrometry, MS）分析。结果:在中性条件下可见593号菌株在110,38,36 KDa左右存在特异条带以及存在4个高表达蛋白位点和6个特异蛋白位点,在28KDa左右蛋白表达量比18号菌株大,相应区域存在4个高表达蛋白位点和2个特异蛋白位点,对其中3个蛋白位点进行MALDI-TOF MS分析后发现,593号菌株的葡糖基转移酶高表达,ABC运载体、丙酮酸激酶特异表达。从pH7.0到pH5.0条件变化中,两菌株均出现了相同特异条带,相同特异蛋白位点;而593号菌株在pH5.0条件下出现1个特有特异条带,6个特有特异蛋白位点和4个特有高表达蛋白位点,对其中5个蛋白位点进行MALDI-TOF MS分析后发现,该菌株在酸性条件下3-磷酸甘油醛脱氢酶、双组分系统组氨酸激酶高表达,感觉信号组氨酸激酶亚型、脂多糖生物合成蛋白、NADH氧化酶特异表达。结论:两菌株在中性条件下表面相关蛋白的蛋白表达存在明显差异,这些差异蛋白,尤其是葡糖基转移酶、ABC运载体、丙酮酸激酶,可能与两菌间代谢和致龋能力存在差异有关。在耐酸反应中,两菌株的表面相关蛋白发生了相似的蛋白表达变化,同时593号菌株又发生了特异的蛋白表达变化,这些特异表达变化的蛋白,尤其是3-磷酸甘油醛脱氢酶、双组分系统组氨酸激酶、感觉信号组氨酸激酶亚型、脂多糖生物合成蛋白、NADH氧化酶,可能与593号菌株的强耐酸性、强致龋性密切相关。
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