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牛分枝杆菌锌铁缺失下基因表达分析及其PHOP缺失载体构建

2020-12-11阅读(586)

牛分枝杆菌锌铁缺失下基因表达分析及其PHOP缺失载体构建

论文摘要

牛结核属于慢性消耗性人畜共患传染病,临床上缺乏快速高效的控制手段。由于多种野生动物可以充当牛结核传播过程中的维持宿主,在世界范围内,牛群中牛结核病的感染率均比较高。目前世界各国普遍采取的控制策略是检疫后捕杀,但该手段所花费的代价高昂,且对某些野生动物并不适用。多数发达国家都在积极研究疫苗,以图对牛结核和野生动物结核的防控起到积极的作用。目前结核疫苗的开发主要基于对传统卡介苗菌株的改良和毒力型牛分枝杆菌菌株的致弱两方面。研究者把卡介苗或重组卡介苗在牛群中进行检验,发现其保护力并不佳,且呈现多变性。在人类疫苗的研究中,已有结核分枝杆菌phop基因缺失疫苗已经进入临床试验。牛结核基因缺失疫苗的开发具有巨大潜力。本研究致力于通过同源重组开发牛结核的基因缺失疫苗。由于该类疫苗的免疫效果、安全性等指标均与所缺失的基因关系甚大,本研究还力图通过结核分枝杆菌全基因组芯片筛选牛分枝杆菌与BCG在锌离子和铁离子缺乏环境下差异表达的基因。通过这些差异基因,一方面可以探讨毒力相关基因及功能,筛选诊断标识；另一方面可以为后续基因的敲除提供基础。本研究获得以下结果：1.缺铁培养条件对BCG菌株生长影响的初步研究缺铁培养条件对BCG菌株生长影响的初步研究表明,在BCG培养过程中使用特异性的铁离子螯合剂DFO螯合培养基中的铁离子后,BCG在生长过程中出现的对数期生长期变短、稳定期菌体总量下降的现象。表明铁离子影响BCG的生长。2.缺铁、缺锌、锌铁双缺培养条件下牛分枝杆菌和BCG基因表达谱分析牛分枝杆菌和BCG分别在CMM (△Fe△Zn)、CMM (△Zn)、CMM (△Fe)和CMM培养基下培养24小时,抽提细菌的总RNA并通过安捷伦公司的结核全基因表达谱双标芯片筛选差异表达基因。以cy3标记M.bovis的cDNA样品、cy5标记BCG的cDNA样品,进行双样本同时检测。共检测了4842个基因的表达,筛选到236个在CMM (△Fe△Zn)、CMM (△Zn)、CMM (△Fe)条件下与CMM培养下比值在2倍以上或者0.5倍以下的基因。通过荧光定量对其中的Rv2962c,Rv3312a,Rv1993c进行验证,结果与芯片相符。基因功能分类显示：236个基因中包含与信号转导相关基因3个；与转录相关基因14个；能量代谢相关基因9个；物质代谢(糖、氨基酸、核苷酸、辅酶、脂类、次生产物、无机盐)相关基共55个。运用分层聚类对所筛选的基因作了初步分类和探讨。3.牛分枝杆菌缺失所用的自杀载体的构建将牛分枝杆菌phop的上游同源序列632bp,下游同源序列587bp以及8kb的筛选标识基因(LacZ,SacB,Hygr)共同插入4.7kb的p2NIL质粒,成功构建出自杀载体。在大肠杆菌中验证筛选标识基因可以正确表达后,使用该自杀质粒对牛分枝杆菌进行电转并筛选,但尚未筛出转化子。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 文献综述
  • 引言
  • 1.1 牛分枝杆菌感染谱概述
  • 1.2 牛结核流行情况概述
  • 1.3 牛结核检测与控制
  • 1.3.1 细菌学检测
  • 1.3.2 免疫学检测
  • 1.3.3 分子生物学检测
  • 1.3.4 牛结核控制策略
  • 1.4 疫苗
  • 1.4.1 卡介苗（BCG）
  • 1.4.2 亚单位疫苗
  • 1.4.3 病毒载体疫苗
  • 1.4.4 减毒苗
  • 1.4.5 小结
  • 1.5 基因与结核疫苗开发
  • 1.5.1 基因
  • 1.5.2 基因筛选
  • 第二章 目的意义
  • 第三章 材料和方法
  • 3.1 实验材料
  • 3.1.1 菌种
  • 3.1.2 载体以及质粒
  • 3.1.3 培养基
  • 3.1.4 工具酶、主要试剂以及仪器
  • 3.1.5 引物
  • 3.1.6 抗生素和缓冲液
  • 3.2 牛分枝杆菌基因表达谱分析
  • 3.2.1 培养基配制
  • 3.2.2 缺铁培养条件对BCG菌株生长影响的初步研究
  • 3.2.3 分枝杆菌离子缺陷条件培养
  • 3.2.4 分枝杆菌RNA提取
  • 3.2.5 总RNA的纯化
  • 3.2.6 RNA甲醛变性电泳
  • 3.2.7 芯片的双色标记和扫描
  • 3.2.8 表达谱芯片的验证
  • 3.3 牛分枝杆菌基因缺失载体的构建
  • 3.3.1 载体构建
  • 3.3.2 重组载体的所携带筛选基因的功能验证
  • 3.3.3 牛分枝杆菌电转化以及筛选
  • 第四章 结果
  • 4.1 基因表达谱分析
  • 4.1.1 最佳添加量的确定
  • 4.1.2 缺铁培养条件对BCG菌株生长的评估
  • 4.1.3 牛分枝杆菌总RNA的提取
  • 4.1.4 差异基因筛选
  • 4.1.5 表达谱芯片验证
  • 4.1.6 基因的分布图以及分层聚类分析
  • 4.2 牛分枝杆菌基因缺失载体的构建
  • 4.2.1 自杀载体的构建
  • 4.2.2 Sac B基因的功能验证
  • 4.2.3 电转化和筛选
  • 第五章 讨论
  • 5.1 铁离子影响细菌生长
  • 5.2 分枝杆菌铁代谢相关基因
  • 5.2.1 铁的感知
  • 5.2.2 铁的捕获
  • 5.2.3 铁的转运
  • 5.2.4 铁的储存
  • 5.2.5 铁的全局调控
  • 5.3 铁的应答
  • 5.4 基因缺失疫苗的安全性问题
  • 5.5 基因重组问题分析
  • 第六章 结论
  • 参考文献
  • 致谢

    • 相关论文文献

    • [1].结核分枝杆菌PhoP系统研究进展[J]. 微生物学报 2017(04)
    • [2].鸟分枝杆菌二元调控系统PhoP基因的克隆与分析[J]. 世界最新医学信息文摘 2015(17)
    • [3].鸟分枝杆菌PhoP功能分析及其基因突变株的构建[J]. 微生物学通报 2016(09)
    • [4].OmpR与PhoP高渗应激下交叉调节伤寒沙门菌基因表达[J]. 华中师范大学学报(自然科学版) 2010(04)
    • [5].phoP调节子对阪崎克罗诺肠杆菌环境耐受力的影响[J]. 食品科学 2019(10)
    • [6].枯草芽胞杆菌NCD-2中调控因子PhoP对fengycin合成的调控作用[J]. 植物病理学报 2014(02)
    • [7].禽致病性大肠杆菌PhoP蛋白调控宿主菌DNA检测方法的建立与应用[J]. 南京农业大学学报 2015(04)
    • [8].鼠伤寒沙门菌中甲基化修饰调控PhoP活性的机制研究[J]. 上海交通大学学报(医学版) 2019(08)
    • [9].结核分枝杆菌PhoP/PhoR基因重组穿梭表达质粒的构建及鉴定[J]. 石河子大学学报(自然科学版) 2013(06)

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