两个长非编码RNA对肌细胞分化相关基因的表达调控

论文摘要

长链非编码RNA （long non-coding RNA, lncRNA）机制和功能的研究近些年已经被大量的报道。lncRNA有多种调控基因的方式,可以通过顺式方式调控邻近的基因或者反式方式调控相关基因。本试验结合前期基因芯片技术,通过分析C2C12细胞增殖时期及分化后2、5和8天4个时期lncRNA和mRNA,鉴定差异表达的lncRNA的组织表达谱,筛选出lncRNA表达高相关性的mRNA基因。在此基础上,利用RNA干扰技术,检测相关的lncRNA对靶基因表达的影响。主要的研究结果如下：1、通过前期基因芯片结果,筛选出与myod1基因相关系数大于0.9的差异表达lncRNA共19个。筛选出与sgcg基因相关系数大于0.9的lncRNA差异表达lncRNA共226个。利用半定量PCR技术检测了lncRNA基因在3月龄小鼠的组织表达谱,筛选出／AK00329、NR001592为背最长肌、腿肌（小腿三头肌）特异表达；AK052919为心肌、舌头、背最长肌中特异表达；AK004418、AK004293、AK048320为广谱表达,但肌肉中呈高表达。2、利用荧光实时定量PCR验证了这4个lncRNA的差异表达情况和表达相关性,分析了AK003290、NR001592、AK004293、AK052919、AK004418及相关mRNA基因达相关性,检测荧光实时定量PCR结果与芯片结果基本一致,两类结果的相关性都是显著的。3、针对AK003290、AK004418、myod1这三个基因设计并筛选出有效地抑制靶基因表达的siRNA序列。在细胞分化时期降低AK003290的表达量会显著下调其相关基因sgcg、trdn 和 myod1的表达,降低AK004418的表达量会下调myh3、myh14、 myh8、myh7 和 trdn的表达。降低myod1的表达量会显著下调其相关的lncRNA AK003290和NR 001592的表达,表明该lncRNA受到了myod1的转录调控。本研究结果为进一步研究肌细胞中lncRNA功能和作用机制奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1 长链非编码RNA的概念及其研究背景
• 2 lncRNA的功能研究
• 2.1 lncRNA生物学功能简介
• 2.2 肌细胞分化过程中lncRNA的研究
• 3 长链非编码RNA的作用机制
• 3.1 lncRNA介导的转录后调控
• 3.2 lncRNA介导的染色质重塑
• 3.3 lncRNA的其他作用形式
• 4 长非编码RNA的研究方法
• 第二章 目的和意义
• 第三章 材料和方法
• 1 实验材料
• 1.1 实验样品
• 1.1.1 组织样品
• 1.1.2 细胞样品
• 1.1.3 克隆载体
• 1.2 主要仪器设备
• 1.3 主要试剂和试剂盒
• 1.4 常用试剂及其配制
• 1.5 lncRNA和mRNA芯片
• 1.6 主要数据库和软件
• 2 试验方法
• 2.1 构建小鼠组织表达谱
• 2.1.1 小鼠组织样总RNA提取
• 2.1.2 RNA质量浓度检测
• 2.1.3 RNA反转录成cDNA
• 2.2 细胞培养
• 2.2.1 细胞复苏与冻存
• 2.2.2 细胞增殖和分化
• 2.3 构建干涉载体与设计siRNA片段
• 2.3.1 AK003290的siRNA表达载体构建
• 2.3.2 设计干涉片段
• 2.4 细胞转染
• 2.4.1 脂质体介导的shRNA转染
• 2.4.2 脂质体介导的siRNA转染
• 2.5 细胞RNA提取及cDNA合成
• 2.6 细胞转染后检测
• 2.6.1 PCR的引物设计
• 2.6.2 荧光实时定量PCR
• 2.6.3 定量数据分析
• 2.7 蛋白检测分析
• 2.7.1 蛋白的提取
• 2.7.2 蛋白质的检测
• 第四章 试验结果
• 1 筛选与肌细胞分化相关的lncRNA
• 1.1 设定标志基因
• 1.2 筛选与mRNA相关的lncRNA
• 1.3 lncRNA与相关基因的相关性分析和表达谱分析
• 1.3.1 lncRNA小鼠组织表达谱分析
• 1.3.2 lncRNA与基因芯片相关基因的分析
• 1.4 lncRNA在细胞分化不同时期表达量及与mRNA
• 2 生物信息学分析
• 2.1 lncRNA的分类
• 2.2 lncRNA与mRNA基因表达相关分析
• 2.3 lncRNA的GO分析
• 2.4 AK003290的转录因子结合位点与Polycomb反应元件预测
• 3 细胞转染
• 3.1 shRNA载体的酶切鉴定
• 3.2 shRNA载体对C2C12细胞转染效果
• 3.2.1 转染片段浓度条件检测
• 3.2.2 二次转染
• 3.3 siRNA对C2C12细胞转染效果
• 3.3.1 转染片段浓度条件检测
• 3.3.2 转染细胞密度检测
• 4 siRNA对AK003290基因的干扰效果及相关基因检测
• 4.1 检测干涉引物效果
• 4.2 不同时期干涉效果和相关基因的检测
• 5 siRNA对AK004418基因的干扰效果及相关基因检测
• 5.1 检测干涉引物效果
• 5.2 不同时期干涉效果和相关基因的检测
• 6 siRNA对myod1基因的干扰效果及相关lncRNA的检测
• 第五章 讨论
• 1 RNAi技术讨论
• 1.1 siRNA片段的设计要点
• 1.2 提高细胞转染效率
• 2 基因筛选
• 3 长非编码RNA调控分析
• 3.1 AK003290和AK004418功能分析
• 3.2 长非编码RNA调控机制的预测
• 4 下一步计划
• 小结
• 参考文献
• 致谢