猪流行性腹泻病毒S蛋白基因在昆虫细胞中的表达及间接ELISA抗体检测方法的初步建立

论文摘要

猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的一种以腹泻、呕吐和脱水为主要特征的猪肠道传染病。此病多发于冬季12月至来年2月寒冬季节,在夏季也可发生。各种年龄的猪都易感,哺乳仔猪、架子猪或育肥猪的发病率可达100%,尤其哺乳仔猪受害最严重,FED的病死率平均为50%。我国自上世纪80年代初开始陆续有PED的发生,已成为重要的猪病毒性腹泻病之一。近年来,流行区域有逐渐扩大的趋势。因此,建立有效快速的PED检测诊断方法非常有必要。但FED与猪传染性胃肠炎（TGE）及猪轮状病毒性腹泻的临床症状、流行病学、病理变化等无明显差异,要确诊需结合实验室诊断方法,目前PED的诊断方法主要有免疫电镜法、免疫荧光法、间接血凝试验、RT-PCR法和ELIS法等。相比而言,ELISA法操作相对简单。研究通过基因的克隆和杆状病毒表达,以建立ELISA检测方法,用于PEDV抗体检测。PEDV的S蛋白在免疫介导中起着重要作用,因此选择S基因为目的基因。根据GenBank数据库中的PEDV-S基因序列设计一对引物,用RT-PCR技术从国内分离的PEDV安徽株中获得大小为1206bp（PS1）的PCR产物,将其克隆至pMD18-T载体,提取质粒经EcoR I和Sa I双酶切鉴定并测序,序列测定结果表明,克隆的PS1蛋白基因完全符合载体阅读框,扩增的PS1基因与PEDV核苷酸序列符合率100%,氨基酸序列符合率100%。将质粒与穿梭载体pFastBac分别进行双酶切,经回收后连接。连接产物转化DH5α,得到重组转移质粒pFastBac-PS1,提取阳性克隆质粒转化到含杆状病毒穿梭载体Bacmid的受体菌E.coliDH10Bac,筛选出阳性菌落得到重组穿梭载体Bacmid-PS1,提取质粒,经PCR鉴定为阳性后,转染到Sf9昆虫细胞,5天后收获病毒。经RT-PCR、IFA、SDS-PAGE和Western-blotting鉴定PS1基因的转录和表达,结果表明,重组杆状病毒PS1蛋白（约47KD）在Sf9昆虫细胞中得到表达。以重组杆状病毒PS1蛋白为抗原,建立检测PEDV血清抗体水平的间接ELISA方法,判定P/N值≥2.2为阳性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 文献综述 猪流行性腹泻研究进展
• 1.猪流行性腹泻病毒结构特点
• 1.1 猪流行性腹泻病毒基因组结构
• 1.2 猪流行性腹泻病毒主要结构蛋白及其功能
• 1.3 主要非结构蛋白及功能
• 1.4 与其它冠状病毒的抗原相关性
• 2.诊断方法
• 1 免疫电镜法
• 2 免疫荧光法
• 3 微量血清中和试验
• 4 ELISA方法
• 5 RT-PCR方法
• 3.组织嗜性和免疫
• 4.治疗与预防
• 参考文献
• 第一章 用猪流行性腹泻病毒S蛋白在昆虫细胞中的表达
• 1.材料和方法
• 2.结果
• 2.1 PEDVS1基因片段RT-PCR扩增
• 2.2 重组转移载体的酶切鉴定和测序
• 2.3 重组表达载体的PCR鉴定
• 2.4 转染后的细胞病变
• 2.5 RT-PCR鉴定重组病毒
• 2.6 表达产物的鉴定
• 3.讨论
• 参考文献
• 第二章 PEDV抗体间接ELISA检测方法的初步建立
• 1.材料和方法
• 2.结果
• 2.1 间接ELISA试验最佳条件
• 2.2 判定标准
• 2.3 阻断试验
• 2.4 特异性试验
• 3.讨论
• 参考文献
• 全文结论
• 附录:常用试剂的配制
• 致谢