论文摘要
目的:单纯干细胞移植后极低的生存能力使其修复梗死心肌的作用十分有限,本研究旨在探讨存活素（Survivin,SVV）基因修饰的骨髓间充质干细胞（BMSCs）离体和在体缺血微环境中的生存能力及其修复大鼠梗死心肌的作用及机制,为新的抗干细胞凋亡移植策略治疗心肌梗死提供理论依据。方法:1.分离幼年大鼠骨髓,采用贴壁法培养扩增BMSCs,对连续传代的第一（P1）、第二（P2）、第三代（P3）细胞进行绝对计数并描绘生长曲线,收集P3细胞进行流氏细胞仪技术鉴定;2.以携带绿色荧光蛋白（GFP）的p-FUGW慢病毒载体系统作为基因转导的媒介,采用体外重组（infusion）技术构建携带SVV基因重组慢病毒表达载体（p-FUGW-SVV）,通过聚合酶链反应（PCR）、酶切和测序的方式鉴定所构建的载体;以脂质体包装SVV重组慢病毒和空病毒（作为实验对照）,采用倍比稀释法测定病毒滴度,以感染复数（MOI）2、8、32的病毒感染P1 BMSCs,以空病毒作为对照,采用Western-blot法检测不同滴度感染的BMSCs SVV蛋白表达;3.将感染的P1 BMSCs传代至P3,采用流氏细胞仪技术定量检测GFP阳性细胞数比例;模拟在体缺血微环境,建立无血清饥饿刺激凋亡诱导模型,将按上述最佳感染条件SVV重组病毒和空病毒处理过的P3 BMSCs（分别称为SVV/GFP+BMSCs组和GFP+BMSCs组）用无血清培养基培养,同时以为未感染的P3 BMSCs作为对照（BMSCs组）,采用流氏细胞仪技术定量检测无血清培养0h、12h、24h、48h、72h的细胞凋亡;4.采用冠脉结扎法建立大鼠心肌梗死模型,72只大鼠随机均分为假手术组、溶剂对照组[vehic组,仅注射100ul磷酸盐缓冲液（PBS）]、空病毒感染的BMSCs移植组（GFP+BMSCs组）和SVV重组慢病毒感染的BMSCs移植组（SVV/GFP+BMSCs组）,以2×106个细胞/只的细胞数注入梗死区心肌,每组再按梗死后7天、14天、28天分为3个亚组（每组6只）,以激光共聚焦扫描显微镜观察移植细胞存活情况,采用多重免疫荧光染色技术评价移植细胞分化;逆转录PCR（RT-PCR）法检测梗死区心肌组织成纤维细胞生长因子（bFGF）、肝细胞生长因子（HGF）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）mRNA表达;免疫组织化学法检测bFGF、HGF蛋白表达及Western-blot检测VEGF蛋白表达;伊红-苏木素（HE）染色评价细胞移植后心肌病理变化;采用免疫组织化学法检测假性血友病因子（vWF）的表达以评价细胞移植后28天毛细血管生成;麦松（Masson）染色检测细胞移植后28天心肌胶原纤维变化,以及采用二次谐波（SHG）成像技术探测梗死区SHG峰值信号定量评价胶原沉积;采用数字高帧频超声心动图观察不同时间点各组心功能变化。结果:1.从P1至P3, BMSCs增殖活力逐渐减低,传至P3时,大鼠BMSCs基本表达CD29、CD44、CD90,而不表达CD14、CD34、CD45。2.采用Infusion技术构建的SVV重组慢病毒表达载体经PCR、酶切及测序鉴定完全正确,瞬时转染293T细胞能够正确表达。3.所包装的SVV重组病毒经浓缩后滴度为1.5×108TU/ml,倒置相差荧光显微镜下,感染大鼠BMSCs发出绿色荧光,荧光强度随MOI值的增加而增强,所表达的SVV蛋白呈现SVV/GFP融合蛋白和SVV蛋白单体两种形式,其中,但以MOI为8的病毒感染大鼠BMSCs,SVV蛋白单体表达最强。4.以MOI为8的病毒感染P1 BMSCs四天后,无论是SVV重组病毒还是空病毒感染的细胞均基本表达GFP,且两组细胞传至P3时GFP阳性细胞均达95%以上。GFP+BMSCs和SVV/GFP+BMSCs均随着无血清刺激时间的延长凋亡细胞逐渐增加,但后者明显少于前者（P﹤0.05）,尤以72h最为明显,凋亡细胞降低了近25%,GFP+BMSCs组与未感染的BMSCs组相比各个时间点均无明显差异（P﹥0.05）。在体内,移植后7天,SVV/GFP+BMSCs组存活细胞的数量是GFP+BMSCs组的3倍多,而28天时接近6倍,除少许移植细胞与宿主心肌细胞融合外未见明显分化为心肌样细胞的现象;SVV/GFP+BMSCs组梗死区bFGF、HGF、VEGF表达明显上调,与vehic组和GFP+BMSCs组相比,差异显著（P﹤0.01）,而GFP+BMSCs组仅于移植后7天时高于vehic组（P﹤0.05）。SVV/GFP+BMSCs组梗死区炎症细胞浸润和瘢痕化明显轻于vehic组和GFP+BMSCs组;移植后28天,SVV/GFP+BMSCs组梗死区毛细血管密度明显增加,约比GFP+BMSCs组多27.7%（P﹤0.01）,而且前者胶原沉积明显轻于后者（P﹤0.01）;GFP+BMSCs移植对心功能的改善表现为从移植后14天开始,并且改善程度有限;而SVV/GFP+BMSCs移植对心功能的保护作用更早（从7天开始）,至28天时,心功能几乎与假手术组相当（P﹥0.05）。结论:SVV基因修饰能够增强大鼠BMSCs在缺血缺氧微环境中的生存能力,移植该基因工程化BMSCs能够进一步保护大鼠心肌梗死后的心功能,并且主要可能通过分泌心肌保护性细胞因子而实现的。
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