论文摘要
研究背景骨关节炎（osteoarthritis, OA）缺损软骨修复是医学界亟待攻克的难题。大量研究表明：OA软骨细胞发生去分化和异常再分化,表达软骨细胞正常分化表型蛋白Ⅱ型胶原和aggrecan减少,而开始表达终末分化表型蛋白X型胶原,以及异常表型Ⅰ型和Ⅲ型胶原等。OA病理环境下软骨细胞的异常分化状态,是软骨细胞修复功能缺失、软骨自我修复失败的原因之一。双向蛋白电泳（2-dimensional gel electrophoresis,2-DE）作为一项高效的差异表达蛋白分离技术,为研究软骨细胞分化异常的分子机制提供了技术支持。但是,由于组织软骨细胞中含有大量蛋白多糖影响2-DE的蛋白等电聚焦,而软骨细胞培养却又可能因离体环境导致OA病理表型以及表型调控分子丢失,以2-DE研究OA软骨细胞表型异常的分子机制因此面临难题。研究目的探索一种既能避免蛋白多糖干扰2-DE等点聚焦,又能避免细胞培养导致OA病理表型以及表型调控分子丢失的实验方案,实现应用2-DE研究OA软骨细胞表型异常分化分子机制的目的。随后,通过研究2-DE分离蛋白的功能及差异表达概况,达到对OA软骨细胞表型调控分子机制更深入的认识。并在此基础上,对部分新发现的软骨细胞表型调控蛋白的功能进行探讨。研究方法新鲜软骨组织取自接受膝关节表面置换手术的OA患者（n=19）和接受截肢手术的下肢损毁伤患者（n=13）或接受全/半髋关节置换的股骨颈骨折患者（n=7）。按照Outerbridge分级,将软骨组织按区域划分为三组：Outerbridge 2级（OAⅡ组）、Outerbridge 1级（OAⅠ组）和正常对照组（Outerbridge 0级）（NC组）。采用0.2%Ⅱ型胶原酶和0.1%透明质酸酶混合物DMEM溶液37℃振荡消化4h,分离软骨细胞。软骨细胞计数后,每106个细胞离心后单独冻存。来自10个不同患者的软骨细胞（共107个软骨细胞）混合后,直接提取胞浆可溶蛋白。改良的Bradford法测定蛋白浓度后,取100μg蛋白/胶上样进行2-DE分析。2-DE凝胶银染显色蛋白点,图像扫描并输入凝胶图像分析软件ImageMaster 2-D Platinum（V3.0）进行差异表达蛋白组间对比。确认的差异表达蛋白点切胶消化,提交质谱分析,以确认蛋白质的身份。根据确认蛋白的生物信息,结合对应差异表达蛋白点在蛋白凝胶中的位置,确认质谱结果的正确性。采用real-time RT-PCR技术对差异表达蛋白质之一,REST转录辅助抑制因子1（REST corepressor 1, CoREST1）,在正常和OA软骨细胞之间的差异表达概况进行验证。随后,采用RNA干扰技术对CoREST1在正常软骨细胞中的基因表达进行敲降,探讨CoREST1表达下调对软骨细胞表型的调控作用。应用real-time RT-PCR技术挑选基因敲降效率最高的siRNA,确认实现CoREST1基因表达的有效敲降。CoREST1成功敲降后,应用real-time RT-PCR观察软骨细胞正常分化表型蛋白Ⅱ型胶原和aggrecan、软骨细胞终末分化表型X型胶原和向成纤维细胞再分化的异常表型蛋白Ⅰ型胶原等表型基因表达水平的变化,研究CoREST1表达下调对软骨细胞表型的影响。随后,采用RNA原位杂交技术观察CoREST1基因表达在正常和OA软骨组织中的变化和表达分布差异。研究结果实验成功实现了软骨细胞胞浆可溶蛋白的2-DE等电聚焦,获得了高质量的2-DE电泳图像。差异对比分析出135个差异表达蛋白点,并实现对其中31个差异表达蛋白点身份的确认。这些蛋白中包括软骨细胞病理表型蛋白annexin A2、神经多肽h3和病理性表达上调的Ⅵ型胶原,以及一系列具有软骨细胞表型调控功能的蛋白质。其中,蛋白二硫键异构酶、前胶原脯氨酸2-酮戊二酸双加氧酶以及TGF-p2在OAⅡ软骨细胞中表达上调,促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶7和REST抑制辅助因子1（REST corepressor 1, CoREST1）在OA组软骨细胞中表达下调。Real-time RT-PCR结果证实OAⅠ组CoREST1 mRNA表达水平相比NC下降45.3%（Mann-Whitney U test,Z=-2.382,P=0.016）,而OAII组下降达49.6%（Mann-Whitney U test, Z=-2.648, P=0.005）,具备组间显著性差异。siRNA对原代培养的软骨细胞CoREST1基因表达的敲降效率达到平均95.7%。CoREST1基因mRNA被有效敲降后,Ⅱ型胶原mRNA表达水平相应下调83.0%（T test,P<0.01）, aggrecan的mRNA表达水平下调50.7%（T test,P<0.01）。此外,Ⅰ型胶原mRNA表达水平也下调91.0%（T test,P<0.01）,而X型胶原的mRNA水平反而上升43.7%,但与CoREST1敲降前相比无显著性差异（T test,P=0.066）。RNA原位杂交结果显示CoRESTl基因表达下降主要见于Outerbridge 1级软骨的过渡层和Outerbridge 2级软骨深层。结论（1）本文通过优化并采用直接从软骨组织中提取软骨细胞,不经培养直接提取可溶蛋白用于双向电泳研究的方案,同时避免细胞培养导致的软骨表型相关蛋白丢失和蛋白多糖对2-DE等点聚焦的干扰,成功实现了应用双向电泳技术研究OA软骨细胞异常分化的分子机理。（2） annexin A2、神经多肽h3和病理性表达上调的Ⅵ型胶原在重度OA软骨细胞中表达升高,验证了既往有关软骨细胞表型异常的文献报道。（3）具有软骨细胞表型调控功能的蛋白在OA软骨细胞中差异表达的矛盾状况,说明OA软骨细胞表型调控的分子机制处于混乱状态。（4）首次发现CoREST1在OA软骨细胞中表达下调的现象,并证实CoREST1下调可导致软骨细胞去分化,提示CoREST1是OA软骨细胞去分化的病因分子。CoREST1在导致去分化的同时,并不诱导软骨细胞终末分化或引起类似培养软骨细胞的向成纤维细胞表型异常再分化。（5） CoREST1基因表达下降主要见于Outerbridge 1级软骨的过渡层和Outerbridge 2级软骨深层,提示OA软骨组织中软骨细胞去分化可能具备区域不均一性。