单分子荧光光谱成像及单分子漂白行为研究

论文摘要

单分子荧光光谱能够识别和检测多组分体系中被不同荧光基团标记的分子,监测微环境变化等。利用单分子荧光光谱研究荧光共振能量转移有助于提高检测准确率,实现单通道荧光共振能量转移检测。荧光共振能量转移能够分辨在1-10nm范围内的荧光信号,弥补了近场和远场纳米显微镜检测范围的空缺,常用于研究分子构象变化,分子相互作用和分子动力学。在单分子荧光检测中很多生物分子自身不发荧光,需要用荧光团标记。荧光团漂白制约了其单分子检测的应用,例如荧光团的漂白使其不能实现长时间在细胞中的追踪。因此研究荧光团的漂白机理对于解决这些问题能够提供有力的理论依据。以往对荧光团漂白的研究中集中在抑制荧光团漂白的因素,而很少研究荧光团漂白前的荧光强度变化,本文涉及了该内容。本文使用普通宽场荧光显微镜主要从单分子荧光光谱、蛋白质间的荧光共振能量转移和单荧光染料分子的漂白行为三个方面展开研究:1、单分子荧光光谱研究。在普通宽场荧光显微镜EMCCD芯片的前方放置透射光栅,它将物镜收集的发射光分为一个零极点和一个一级条纹。考察了Alexa488标记的BSA和Alexa594标记的antiBSA及QD525的光谱信息,测定了光谱分辨率。零级点的位置对应未放置光栅前的光斑位置,它和一级条纹荧光最强处的像素差值能够通过光谱分辨率转化为发射光波长。将一级条纹进行拟合后得到和系综光谱吻合的单分子荧光光谱。单分子荧光光谱能够用于分子识别,检测荧光共振能量转移,研究量子点蓝移等。2、蛋白质之间的荧光共振能量转移研究。荧光共振能量转移技术广泛用于研究分子构象变化、相互作用和分子反应动力学。本工作利用透射光栅的分光作用,以生物化的牛血清白蛋白和链酶亲和素为研究体系初步实现了蛋白质之间荧光共振能量转移的单通道检测。3、在单分子水平上研究了罗丹明B染料的漂白行为。在不同溶剂和不同pH值的缓冲液中考察溶剂极性和离子电荷浓度对罗丹明B分子在单分子水平和系综水平的影响。初步得出罗丹明B在不同溶剂中的荧光强度在单分子水平和系综水平不一致的结论。同时研究了罗丹明B在不同极性溶剂和不同电荷浓度的缓冲溶液中单步漂白行为。考察了罗丹明B在荧光漂白前的荧光强度变化,得出了罗丹明B单步漂白在荧光漂白前的荧光强度变化是一个随时间变化的线性函数并且该函数的斜率服从洛伦兹分布的结论。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 单分子荧光成像方法
• 1.1.1 显微镜
• 1.1.2 检测器
• 1.1.3 荧光团
• 1.1.4 提高单分子检测效率
• 1.2 单分子检测的适用体系
• 1.2.1 溶液体系
• 1.2.2 界面
• 1.2.3 细胞体系
• 1.3 单分子荧光共振能量转移应用
• 1.3.1 生物大分子构象变化研究
• 1.3.2 生物大分子动力学研究
• 1.3.3 分子相互作用
• 1.3.4 高灵敏检测应用
• 1.4 本论文拟开展的工作
• 第2章 基于宽场荧光显微镜的单分子荧光光谱
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 试剂与仪器
• 2.2.2 实验参数
• 2.2.3 样品标记与制备
• 2.2.4 制片上样
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 确认单分子
• 2.3.2 测定光栅分辨率
• 2.3.3 单分子荧光光谱
• 2.3.4 双透射光栅光谱
• 2.4 小结
• 第3章 光谱成像应用
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 试剂与仪器
• 3.2.2 标记方法
• 3.2.3 上样制片
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 确认单分子
• 3.3.2 荧光共振能量转移条件探讨
• 3.3.3 确认蛋白分子间发生荧光共振能量转移
• 3.4 小结
• 第4章 单分子漂白行为研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 试剂与仪器
• 4.2.2 实验参数
• 4.2.3 样品制备
• 4.2.4 罗丹明 B 性质讨论
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 巯基乙醇对罗丹明 B 漂白的影响
• 4.3.2 罗丹明 B 漂白前荧光强度变化考察
• 4.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录
• 附录B 荧光滤光块光谱谱图
• 附录C 罗丹明B 在单分子和系综水平荧光强度比较
• 附录D 罗丹明B 漂白斜率统计图
• 附录E 罗丹明B 质谱谱图
• 致谢