小鼠形觉剥夺性近视眼模型Sonic hedgehog信号通路的表达及干预研究

论文摘要

前言随着近视眼在全球的发病率不断上升,针对近视眼的发病机制及防治方法的研究已成为全球公共卫生工作和防盲治盲的重点。目前有大量研究集中于寻找介导近视眼发生的信号机制,这其中包括各种胚胎期调控眼球发育的信号通路。Sonic hedgehog（Shh）是参与胚眼发育的关键调控因子。研究发现Shh的表达水平在小鸡实验性近视模型中发生改变,因此推测Shh可能是调控近视眼发生的信号通路之一。目前,对于Shh在近视眼发病机制中的作用,国内外尚缺乏系统性的研究,本课题围绕Shh在小鼠形觉剥夺性近视眼模型中的作用展开实验,目的是进一步阐明近视眼的发病机制,探索近视眼防治的新方法。第一部分:小鼠形觉剥夺性近视眼模型的建立目的:探讨建立小鼠形觉剥夺性近视眼模型（form-deprivation myopia,FDM）的可行性。比较半透明膜法和眼睑缝合法诱导小鼠FDM的效果。方法:96只出生13-14天的C57B/L6小鼠随机分为半透明膜组（n=44）、眼睑缝合组（n=36）和对照组（n=16）。小鼠开睑当天即予佩戴半透明膜眼罩或缝合眼睑（均为单眼）。分别于形觉剥夺1周、2周和4周后验光、测量眼轴长度,并取视网膜行光镜、电镜检查。结果:形觉剥夺1周、2周及4周后,半透明膜组的遮盖眼与对侧眼的屈光度差异分别为:-5.77±2.24D、-6.16±1.04D和-8.43±0.86D,眼轴差异分别为:0.030±0.044 mm、0.040±0.074 mm和0.071±0.088mm;三个时间点眼瞼缝合组的缝合眼与对侧眼的屈光度差异分别为:-5.83±2.33D、-6.13±1.19D和-9.33±0.94D,眼轴差异分别为:0.033±0.028mm、0.039±0.058mm和0.078±0.064mm;对照组双眼屈光度差异分别为:-0.10±1.25D、0.08±1.86 D和0.30±0.84D,眼轴差异分别为:0.020±0.090 mm、-0.017±0.056mm和0.008±0.137mm。1周及2周时半透明膜法和眼瞼缝合法诱导的近视眼模型在屈光度及眼轴改变方面的差异均无统计学意义,4周时眼睑缝合法诱导的近视程度大于半透明膜法（t=2.59,P=0.016）。与对照眼相比,FDM眼光镜下未见视网膜形态结构发生明显异常改变,电镜下发现FDM眼视网膜感光细胞外节膜盘间距增大,排列紊乱。结论:半透明膜法或眼睑缝合法均可在C57B/L6小鼠中诱导出轴性FDM模型,两种方法诱导FDM的效果相近。建立小鼠FDM模型是可行的。第二部分:形觉剥夺性近视眼小鼠视网膜Sonic hedgehog信号通路分子表达的研究目的:研究Sonic hedgehog（Shh）及其下游信号分子Patched-1（Ptc-1）和Gli-3在FDM及正常小鼠视网膜组织的表达情况。方法:150只出生13-14天的C57B/L6小鼠随机分为形觉剥夺组和对照组各75只。采用半透明膜法诱导FDM,分别于1周、2周及4周后验光并测量眼轴。每组各随机取3只（1×3）用于免疫荧光标记,6只（2×3）用于实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitative reverse transcriptionpolymerase chain reaction,real-time PCR）,12只（4×3）用于Western-blot分析,检测FDM与正常小鼠的视网膜组织中Shh、受体Ptc-1以及核转录因子Gli-3在视网膜组织、mRNA及蛋白水平的表达情况。结果:免疫荧光染色发现Shh、Ptc-1及Gli-3在出生后的小鼠视网膜中主要分布于神经节细胞层到外丛状层。Gli-3在非形觉剥夺眼的视网膜中主要分布于神经节细胞的细胞浆中,而在FDM眼中则主要表达于神经节细胞的细胞核内。根据荧光强度未能分辨FDM眼中上述各分子表达水平的变化。Real-time PCR及Western-blot检测发现:形觉剥夺1周及2周后FDM眼视网膜组织中的Shh mRNA及蛋白的表达水平均升高,4周后无显著改变;形觉剥夺1周后FDM眼视网膜组织中Ptc-1mRNA及蛋白水平均下降,2周后蛋白水平仍降低而mRNA水平无显著改变;形觉剥夺1周后FDM眼视网膜组织中Gli-3mRNA及蛋白水平均升高,2周后mRNA水平仍升高而蛋白水平则降低,4周后mRNA水平无显著改变,而蛋白水平降低。结论:出生以后,Shh及其下游信号分子主要表达于小鼠视网膜的神经节细胞层和内核层。发生于FDM眼中的Gli-3的核转位及Shh通路分子表达水平的改变提示形觉剥夺可促使Shh信号通路激活。第三部分:改变Sonic hedgehog信号通路活性对小鼠形觉剥夺性近视眼模型的影响目的:了解兴奋或阻断Shh信号通路对小鼠FDM模型的影响。方法:336只出生13-14天C57BL/6小鼠,随机分为Shh-N注射组和cyclopamine（特异性Shh通路阻断剂）注射组各168只。每组根据是否形觉剥夺（半透明膜法）及不同的药物注射剂量再各分为6组。分别行玻璃体腔内注射Shh-N或cyclopamine,形觉剥夺组注射遮盖眼,非形觉剥夺组随机选取一眼注射,两组均以未注射的对侧眼作为内部参照。两种药物均为隔天注射一次,共4次。最后一次注药后3天验光、测量眼轴长度并取视网膜行光镜、免疫荧光染色及Western-blot分析,检测注药后小鼠的屈光度、眼轴长度、视网膜病理形态及Shh、Ptc-1和Gli-3蛋白表达水平的变化。结果:形觉剥夺眼内注射Shh-N促进FDM的形成及眼轴的延长,注射cyclopamine则抑制FDM的形成及眼轴的延长。非形觉剥夺眼内注射Shh-N可导致相对近视及眼轴延长,注射cyclopamine导致相对远视并抑制眼轴延长。以上效应均呈剂量相关性,以高浓度组较为显著。光镜下见注药后的视网膜形态无明显异常改变。免疫荧光染色发现非形觉剥夺眼内注射Shh-N促进Gli-3的核转位,形觉剥夺眼内注射cyclopamine部分抑制Gli-3的核转位。Western免疫印迹法发现注射Shh-N后Ptc-1下调而Gli-3上调;注射cyclopamine后Shh、Gli-3下调而Ptc-1上调。结论:激活Shh通路促进FDM的形成及眼轴的延长,并促进正常小鼠的眼球向近视方向发展。阻断Shh通路抑制FDM的形成及眼球的延长,并促使正常小鼠眼球向远视方向发展。Shh通路阻断剂有可能成为近视眼预防及治疗的新选择。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 一. 关于实验性近视眼模型
• 二. 关于近视眼的发生机制研究
• 三. Sonic hedgehog通路及其在近视眼中的研究
• 第一部分 小鼠形觉剥夺性近视眼模型的建立
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分 形觉剥夺性近视眼小鼠视网膜Sonic hedgehog信号通路分子表达的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第三部分 改变Sonic hedgehog信号通路活性对小鼠形觉剥夺性近视眼模型的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 附录一:综述
• 附录二:在读期间发表论文情况
• 致谢