亚麻脂肪酸去饱和酶基因FAD3B表达载体构建、鉴定与表达研究及牛转基因细胞中内参基因稳定性评价

论文摘要

Omega-3多不饱和脂肪酸（ω-3PUFA）对人体健康非常重要,但哺乳动物自身不能合成ω-3PUFA。为了使哺乳动物体内表达去饱和脂肪酸酶,使动物体内能够实现从ω-6到ω-3PUAF的转化,动物转基因技术是有效且可行的手段。目前,线虫以及植物和菌类中的脂肪酸去饱和酶基因已经被用于转基因动物的研究。本文从亚麻中筛选出多不饱和脂肪酸去饱和酶基因,构建成转基因载体,并在细胞、胚胎和模式动物水平上进行验证。试验一：克隆亚麻FAD3B基因及构建具有不同启动子的真核过表达载体亚麻（Linum usitatissimum Linn）俗名胡麻,其种子中亚麻酸含量高达50.1%（中国油脂植物数据库）,说明亚麻中ω-3脂肪酸去饱和酶的活性非常强。本试验提取高脂含量的亚麻种子RNA,通过RT-PCR克隆得到亚麻脂肪酸去饱和酶基因FAD3B。构建了pIRES-AcGFP-CMV-FAD3B与pIRES-AcGFP-CAG-FAD3B两个具有不同启动子的过表达真核表达载体,经过PCR和酶切鉴定重组载体构建正确。试验二：FAD3B转基因载体的细胞、胚胎及转基因小鼠的制备和验证通过脂质体法将两个表达载体分别导入牛成纤维细胞,检测瞬时转染效率。发现在六孔板中接种1×105个细胞,24h后进行转染,瞬时转染效率最高达到（30.71±4.65）%。经G418筛选后获得转基因细胞,转基因细胞的生长明显受到抑制。经qRT-PCR检测表明,FAD3B在转基因细胞中的表达量水平pIRES-AcGFP-CMV-FAD3B和pIRES-AcGFP-CAG-FAD3B转基因细胞中FAD3B基因的mRNA拷贝数分别是1.53×105和1.36×105,前者FAD3B的表达水平明显高于后者,约为后者的1.125倍。通过核移植方法得到转基因克隆牛胚胎,在胚胎水平检测到了FAD3B基因的表达。转基因克隆胚胎的发育与正常体细胞克隆胚胎的发育类似,为以后转基因大家畜的研究提供了可靠的实验依据。转基因小鼠可以作为疾病模型,此外可以验证转基因载体的设计在个体水平是否成功。采取原核注射法得到84只小鼠,经PCR检测没有得到转基因小鼠,此项工作仍在进行中。试验三：牛转基因细胞中内参基因的稳定性评估和候选内源基因的表达差异检测以不同过表达水平的转基因细胞作为实验材料,通过qRT-PCR评价了牛转基因细胞中9种候选内参基因ACTB、GAPDH、18S rRNA、UXT、PPP1R11、 RPS15A、SF3A1、EEF1A2和HMBS的稳定性,根据GeNornm、NormFinder和BestKeeper三种统计学算法得到的稳定性值对基因进行排序。内参基因稳定性的综合排序为PPP1R11>EEF1A2>18S rRNA>RPS15A>GAPDH>HMBS>UXT> ACTB>SF3A1,PPP1R11和EEF1A2是最稳定的内参基因。稳定内参的选择可以更加准确地校正基因的表达水平,从而为阐述基因的功能奠定了坚实的基础。检测基因调控网络中相关基因的表达差异是评价转基因有效性和安全性的手段之一。主要选择了脂代谢途径及信号通路中转录因子等相关功能基因。在脂质体转染、G418筛选以及空载体表达后,脂代谢途径中的转录因子的表达量发生了很大变化。FAD3B的过表达导致了内源基因表达水平下降,这些结果说明外源基因转入后,可能造成了转基因细胞调控网络的紊乱。本研究为亚麻去饱和脂肪酸酶基因在转基因动物中的应用研究提供一些科学依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 缩略词表
• 第一部分 实验研究
• 第一章 克隆亚麻FAD3B基因及构建具有不同启动子的过表达载体
• 摘要
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 亚麻RNA提取
• 1.2.2 合成cDNA及内参基因检测
• 1.2.3 FAD3B基因的引物设计
• 1.2.4 克隆FAD3B基因和序列分析
• 1.2.5 pIRES-AcGFP-CMV-FAD3B表达载体构建
• 1.2.6 pIRES-AcGFP-CAG-FAD3B表达载体构建
• 1.2.7 PCR和酶切鉴定两个具有不同启动子的表达载体
• 1.3 结果与分析
• 1.3.1 亚麻RNA和cDNA质量鉴定
• 1.3.2 克隆FAD3B基因及验证
• 1.3.3 载体构建过程中片段测序结果
• 1.3.4 两个具有不同启动子的表达载体
• 1.3.5 PCR和酶切鉴定两个具有不同启动子的表达载体
• 1.4 讨论
• 参考文献
• 第二章 FAD3B转基因载体的细胞、胚胎及转基因小鼠的验证
• 摘要
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 脂质体法转染牛胎儿成纤维细胞
• 2.2.2 检测转染效率与转基因细胞生长活性
• 2.2.3 转基因细胞RT-PCR检测
• 2.2.4 FAD3B基因定量引物及其标准曲线
• 2.2.5 绝对定量PCR检测FAD3B基因的表达水平
• 2.2.6 制备转基因克隆牛胚胎
• 2.2.7 转基因克隆牛胚胎的转基因检测
• 2.2.8 小鼠原核注射
• 2.2.9 制备鼠尾基因组
• 2.2.10 转基因小鼠PCR检测
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 牛胎儿成纤维细胞转染效率
• 2.3.2 转基因细胞及其生长曲线
• 2.3.3 转基因细胞RT-PCR检测
• 2.3.4 预PCR和溶解曲线证明定量引物特异性以及制作标准曲线
• 2.3.5 绝对定量PCR检测转基因细胞中FAD3B基因的表达水平
• 2.3.6 转基因克隆胚胎的发育和FAD3B基因的表达
• 2.3.7 原核注射出生的小鼠统计
• 2.3.8 转基因小鼠基因组的检测
• 2.4 讨论
• 参考文献
• 第三章 牛转基因细胞中内参基因稳定性和候选内源基因的表达差异
• 摘要
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.2.1 内参基因的选择
• 3.2.2 候选内源基因的选择
• 3.2.3 定量引物的设计
• 3.2.4 引物扩增效率
• 3.2.5 SYBR荧光实时定量PCR
• 3.2.6 数据分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 预PCR检测内参基因定量引物
• 3.3.2 内参基因的标准曲线及溶解曲线
• 3.3.3 评价候选内参基因的稳定性
• 3.3.4 候选内源基因引物的特异性检测
• 3.3.5 候选功能基因的表达差异
• 3.4 讨论
• 参考文献
• 全文小结
• 第二部分 文献综述
• 第一章 ω-3脂肪酸去饱和酶基因制备转基因动物的研究进展
• 1.1 多不饱和脂肪酸的分类
• 1.2 多不饱和脂肪酸的生理功能
• 1.3 不同物种中ω-6和ω-3 PUFA的合成
• 1.4 线虫fat-1基因通过转基因技术合成多不饱和脂肪酸
• 1.5 植物和菌类的脂肪酸去饱和酶基因通过转基因技术合成多不饱和脂肪酸
• 第二章 哺乳动物基因表达研究中内参基因的选择
• 2.1 实时定量RT-PCR（quantitative real-time RT-PCR）及其优点
• 2.2 内参基因的作用及应具备的条件
• 2.3 常用内参基因的缺陷
• 2.4 哺乳动物中内参基因的选择的研究进展
• 2.5 内参基因稳定性的分析方法
• 参考文献
• 致谢
• 硕士期间论文发表情况