论文摘要
研究背景及目的心肌纤维化是高血压左心室重构的重要病理改变之一,也是心脏舒张功能障碍的主要原因,更是心功能由代偿期向失代偿期转变的关键。因此,预防和逆转心肌纤维化、恢复心功能对高血压靶器官保护具有重要意义。大量研究表明,来源于心脏肥大细胞的糜酶参与心血管的病理性重构,在高血压、心肌梗死、心肌病、心力衰竭、冠脉支架植入术后再狭窄、动脉粥样硬化及动脉瘤等疾病的发生、发展中具有重要作用。文献报道,糜酶能抑制血管平滑肌细胞增殖,并促进心肌细胞肥大。心脏成纤维细胞（CFs）是心肌纤维化的主要效应细胞,其过度增殖及胶原合成增多是心肌纤维化的病理基础。但糜酶对CFs增殖与胶原合成有何影响及其信号转导机制目前尚不清楚。近年研究表明,糜酶能激活转化生长因子-β1（TGF-β1）的前体,但糜酶能否通过活化的TGF-β1诱导CFs增殖及胶原合成目前还不明确。Smads蛋白家族是近年发现的参与TGF-β1信号转导的细胞内效应分子之一,特异性地调节TGF-β1靶基因的表达。业已证实,TGF-β1/Smads信号通路的激活参与肝、肺、肾、腹膜和皮肤等器官和组织的纤维化病变,但该信号通路是否在高血压心肌纤维化的病理过程中发挥重要作用尚不清楚。过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs）是一类配体依赖的核转录因子,包括α、β/δ和γ三种亚型。近年来关于PPARγ及其激动剂噻唑烷二酮类药物在代谢综合征中的心血管保护作用已进行了广泛研究,但对于PPARα的研究相对较少。晚近研究表明,PPARα在心肌组织呈高水平表达,对心肌肥厚发挥负调控作用,这预示着PPARα信号通路将成为高血压左心室肥厚防治新策略的一个有效靶点。贝特类调脂药对原发性高甘油三脂血症有肯定的疗效,自从被确认为PPARα的特异性激动剂以来,非诺贝特调脂以外的心血管保护效应倍受关注。在体外培养的心肌细胞,非诺贝特可抑制多种炎症介质及细胞因子引起的心肌细胞肥大,但其对CFs增殖与胶原合成有无影响及其细胞内信号通路,目前尚不十分清楚。此外,新近研究表明,PPARγ激动剂可下调TGF-β1基因表达从而抑制肾间质纤维化,其机制可能与阻断TGF-β1/Smads信号通路有关。但是,在糜酶介导心肌纤维化的病理过程中有无TGF-β1/Smads及PPARα信号途径的参与,以及这两条信号转导通路之间是否存在“信息交流”（cross-talk）,目前也不明确,有待探讨。因此,本研究在细胞和分子水平上观察心脏糜酶对大鼠CFs增殖、胶原合成的影响及其细胞内信号转导通路,探讨糜酶在心肌纤维化中的作用机制;研究PPARα及其激动剂非诺贝特对糜酶介导的TGF-β1/Smads信号途径的调控作用,阐明非诺贝特逆转高血压心肌纤维化的分子机制。旨在为临床防治高血压左室重构提供理论依据和治疗新思路。研究方法本研究以体外培养的SD大鼠CFs为研究对象,采用MTT比色法、放射性核素掺入实验、流式细胞仪细胞周期分析、ELISA、RT-PCR及蛋白免疫印记等方法和技术,观察:（1）糜酶对大鼠CFs增殖和胶原合成的影响;（2）糜酶对大鼠CFs的TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7 mRNA和蛋白表达的影响;（3） PPARα激动剂非诺贝特对糜酶诱导的大鼠CFs增殖和胶原合成的影响:（4）非诺贝特干预对大鼠CFs的PPARα、TGF-β1mRNA和蛋白表达以及Smad2/3、p-Smad2/3、Smad7蛋白表达的影响。研究结果（1）不同浓度的糜酶作用24 h,CFs的数目呈浓度依赖性增加,15、30和60 ng/ml组A490值分别为0.263±0.033、0.348±0.031和0.387±0.026,均较对照组（0.201±0.019）显著增加（P＜0.01）。TGF-β1中和抗体预处理组和丝/苏氨酸激酶抑制剂预处理组的A490值均明显低于30 ng/ml糜酶组（P＜0.05或P＜0.01）,AT1受体拮抗剂预处理组和AT2受体拮抗剂预处理组的A490值与糜酶组比较,均无显著性差异（P＞0.05）。（2） CFs的DNA合成随糜酶浓度的增加而增多,15、30和60 ng/ml组3H-TdR掺入量分别为319±29、372±43和401±47（cpm/孔）,较对照组（252±35 cpm/孔）明显升高（P＜0.01）。10μmol/L糜酶抑制剂预处理组的3H-TdR掺入量显著低于30ng/ml糜酶组（P＜0.01）。（3）细胞周期分析结果表明,15、30和60 ng/ml糜酶作用24 h,CFs的G0/G1期细胞百分率均较对照组显著降低（P＜0.05或P＜0.01）,S期细胞百分率和增殖指数（PI）则较对照组明显增高（P＜0.05或P＜0.01）,G2/M期细胞百分率与对照组比较无显著性差异（P＞0.05）。10μmol/L糜酶抑制剂预处理组G0/G1期细胞百分率显著高于30 ng/ml糜酶组（P＜0.01）,S期细胞百分率和PI明显低于糜酶组（P＜0.01）,G2/M期细胞百分率与糜酶组及照组比较均无明显差异（P＞0.05）。（4）随着糜酶浓度的增高,CFs总胶原合成呈递增趋势,15、30和60 ng/ml组3H-脯氨酸掺入量分别为520±75、684±62和769±58（cpm/孔）,均较对照组（435±60 cpm/孔）显著增加（P＜0.05或P＜0.01）。TGF-β1中和抗体预处理组和丝/苏氨酸激酶抑制剂预处理组的3H-脯氨酸掺入量均显著低于30 ng/ml糜酶组（P＜0.05或P＜0.01）;AT1受体拮抗剂预处理组和AT2受体拮抗剂预处理组的3H-脯氨酸掺入量与糜酶组比较无显著性差异（P＞0.05）。（5）不同浓度的糜酶作用24 h,Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达水平呈浓度依赖性增加,其中15、30和60 ng/ml组Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA表达水平均较对照组显著升高（P＜0.01）,但7.5 ng/ml组与对照组比较无显著性差异（P＞0.05）。（6）随着糜酶浓度的增高,CFs培养上清中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量呈递增趋势,其中15、30和60 ng/ml组Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白含量均较对照组明显增加（P＜0.05或P＜0.01）,但7.5ng/ml组与对照组比较无显著性差异（P＞0.05）。（7） 15、30和60 ng/ml糜酶作用3h,TGF-β1 mRNA表达水平分别为0.698±0.051、1.096±0.078和1.242±0.065,均较对照组（0.299±0.035）明显增加（P＜0.01）。TGF-β1中和抗体预处理组的TGF-β1 mRNA表达水平明显低于30 ng/ml糜酶组（P＜0.05或P＜0.01）,但AT1受体拮抗剂和AT2受体拮抗剂预处理组的TGF-β1 mRNA水平与糜酶组比较,均无显著性差异（P＞0.05）。（8） 15、30和60 ng/ml糜酶作用6 h,TGF-β1蛋白表达水平分别为0.968±0.069、1.782±0.058和2.656±0.085,均较对照组（0.333±0.023）明显升高（P＜0.05或P＜0.01）。TGF-β1中和抗体预处理组的TGF-β1蛋白表达水平较30 ng/ml糜酶组显著降低（P＜0.05或P＜0.01）,但AT1受体拮抗剂和AT2受体拮抗剂预处理组的TGF-β1蛋白水平与糜酶组比较,均无明显差异（P＞0.05）。（9）不同浓度的糜酶作用6 h,Smad2和Smad3的mRNA表达水平与对照组比较,均无显著性差异（p＞0.05）。（10）在30 ng/mL糜酶作用下,3 h、6 h、12 h和24 h组p-Smad2/3表达水平均较对照组显著升高（P＜0.05或P＜0.01）;Smad2/3蛋白表达水平与对照组比较均无显著性差异（P＞0.05）。3 h组Smad7蛋白表达水平较对照组显著升高（P＜0.05）;6 h、12 h和24 h组Smad7蛋白水平均显著低于对照组（P＜0.05或P＜0.01）。（11）不同浓度的非诺贝特预处理后,CFs的数目呈递减趋势,其中50和100μmol/L组的A490值均较糜酶组显著较少（P＜0.05或P＜0.01）。非诺贝特与其拮抗剂共同干预组的A490值与糜酶组比较无显著性差异（P＞0.05）。100μmol/L非诺贝特单独作用对CFs的数目无明显影响（P＞0.05）。（12）不同浓度的非诺贝特预处理后,CFs的DNA合成呈浓度依赖性减少,其中50和100μmol/L组均较糜酶组明显减少（P＜0.01）。非诺贝特与其拮抗剂共同干预组的3H-TdR掺入量与糜酶组比较无显著性差异（P＞0.05）。100μmol/L非诺贝特单独作用下,3H-TdR掺入量无明显变化（P＞0.05）。（13）不同浓度的非诺贝特预处理后,CFs的G0/G1期细胞百分率呈递增趋势,S期细胞百分率和PI则呈递减趋势,其中50和100μmol/L组与糜酶组比较均有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）。100μmol/L非诺贝特单独作用下,CFs的G0/G1期细胞百分率、S期细胞百分率和PI均无明显变化（P＞0.05）。（14） 10、50和100μmol/L非诺贝特预处理组CFs的总胶原合成呈浓度依赖性减少,其中50和100μmol/L组的3H-脯氨酸掺入量均较糜酶组显著降低（P＜0.01）。非诺贝特与其拮抗剂共同干预组的3H-脯氨酸掺入量与糜酶组比较无显著性差异（P＞0.05）。100μmol/L非诺贝特单独作用对3H-脯氨酸掺入量无明显影响（P＞0.05）。（15）不同浓度的非诺贝特预处理后,CFs的Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达水平均呈递减趋势,其中50和100μmol/L组均较糜酶组显著减低（P＜0.01）。非诺贝特与其拮抗剂共同干预组的Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达水平与糜酶组比较无显著性差异（P＞0.05）。100μmol/L非诺贝特单独作用对Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达均无显著影响（P＞0.05）。（16）不同浓度的糜酶作用6 h,CFs的PPARαmRNA水平呈递减趋势,其中15、30和60 ng/ml组均较对照组明显减低（P＜0.01）。10、50和100μmol/L非诺贝特预处理后,CFs的PPARαmRNA表达水平呈浓度依赖性增加,其中50和100μmol/L组均较糜酶组显著增加（P＜0.05或P＜0.01）。100μmol/L非诺贝特单独作用后,PPARαmRNA表达水平较对照组明显升高（P＜0.01）。（17）不同浓度的糜酶作用12 h,CFs的PPARα蛋白水平呈浓度依赖性下降,其中15、30和60 ng/ml组较对照组明显减少（P＜0.05或P＜0.01）。10、50和100μmol/L非诺贝特预处理后,CFs的PPARα蛋白表达水平呈递增趋势,其中50和100μmol/L组较糜酶组明显增加（P＜0.01）。100μmol/L非诺贝特单独作用组的PPARα蛋白表达水平较对照组显著升高（P＜0.01）。（18）不同浓度的非诺贝特预处理后,CFs的TGF-β1 mRNA表达水平呈递减趋势,其中50和100μmol/L组均较糜酶组明显减少（P＜0.01）。非诺贝特与其拮抗剂共同干预组的TGF-β1 mRNA水平与糜酶组比较无显著性差异（P＞0.05）。100μmol/L非诺贝特单独作用下,TGF-β1 mRNA水平无明显变化（P＞0.05）。（19）10、50和100μmol/L非诺贝特预处理组CFs的TGF-β1蛋白表达水平呈浓度依赖性减少,其中50和100μmol/L组均较糜酶组显著减少（P＜0.05或P＜0.01）。100μmol/L非诺贝特单独作用对TGF-β1蛋白水平为无显著影响（P＞0.05）。（20）不同浓度的糜酶作用12h,CFs的Smad2/3蛋白表达水平与对照组比较均无明显差异（P＞0.05）。不同浓度的非诺贝特预处理后,Smad2/3蛋白表达水平亦无明显变化（P＞0.05）。（21） 15、30和60 ng/ml糜酶作用6h,CFs的p-Smad2/3蛋白表达水平均较对照组明显升高（P＜0.05或P＜0.01）。不同浓度的非诺贝特预处理后,p-Smad2/3蛋白表达水平呈递减趋势,其中50和100μmol/L组均较糜酶组显著下降（P＜0.05或P＜0.01）。100μmol/L非诺贝特单独作用下,p-Smad2/3的蛋白表达水平无明显变化（P＞0.05）。（22） 15、30和60 ng/ml糜酶作用6 h,Smad7 mRNA表达水平均较对照组显著减少（P＜0.05或P＜0.01）,不同浓度的非诺贝特预处理后,CFs的Smad7 mRNA表达水平呈浓度依赖性增加,其中50和100μmol/L组均较糜酶组明显增加（P＜0.05或P＜0.01）。100μmol/L非诺贝特单独作用对Smad7 mRNA表达水平无显著影响（P＞0.05）。（23） 15、30和60 ng/ml糜酶作用12 h,CFs的Smad7蛋白表达水平均较对照组明显降低（P＜0.01）。不同浓度的非诺贝特干预后,Smad7蛋白表达水平呈浓度依赖性升高,其中50和100μmol/L组均较糜酶组明显升高（P＜0.05或P＜0.01）。100μmol/L非诺贝特单独作用下,Smad7蛋白表达水平无明显变化（P＞0.05）。研究结论（1）糜酶以浓度依赖的方式促进SD大鼠CFs增殖和胶原合成,提示心脏糜酶可能在心肌纤维化的发生、发展中具有重要的作用。（2）糜酶可上调TGF-β1表达,同时促进Smad2/3的磷酸化、下调Smad7表达,说明糜酶可激活TGF-β1/Smads信号通路。（3） TGF-β1中和抗体及丝/苏氨酸激酶抑制剂可抑制糜酶介导的CFs增殖和胶原合成作用,但血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂（ARB）对糜酶诱导的CFs增殖、胶原合成及TGF-β1产生均无明显影响。表明TGF-β1/Smads信号通路参与糜酶致心肌纤维化作用,并且该作用与AngⅡ途径无关。（4） PPARα激动剂非诺贝特以浓度依赖的方式抑制糜酶诱导的大鼠CFs增殖和胶原合成,提示非诺贝特可能具有逆转心肌纤维化的作用。（5）非诺贝特通过激活PPARα抑制TGF-β1的生成;同时下调p-Smad2/3表达、上调Smad7表达。这可能是非诺贝特抑制CFs增殖和胶原合成,从而逆转心肌纤维化的分子生物学机制之一。（6） PPARα途径和TGF-β1/Smads信号通路可能存在信息交流:即活化的PPARα可下调TGF-β1的表达,进而抑制Smad2/3的磷酸化,并上调Smad7的表达,从而抑制TGF-β1的信号传导,对TGF-β1/Smads通路发挥负调控作用。综上所述,不难看出心脏糜酶可诱导CFs增殖和胶原合成,因而具有促进心肌纤维化的作用,该作用的细胞内信号转导机制与TGF-β1表达上调、Smad2/3磷酸化增加以及Smad7表达下调有关。PPARα激动剂非诺贝特可抑制糜酶介导的心肌纤维化反应,从而发挥其调脂以外的心血管保护效应,其分子机制可能是通过激活PPARα抑制TGF-β1生成,从而下调p-Smad2/3表达并上调Smad7表达。因此,非诺贝特可能对高血压心肌纤维化发挥负调控作用,本研究结果有望为高血压左心室重构的发生提供理论依据和新的治疗靶点。
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