口蹄疫病毒VP1T、B细胞表位融合蛋白及与大肠杆菌肠毒素融合表达产物的研究

论文摘要

以一株O型口蹄疫病毒（FMDV）外壳蛋白VP1基因为模板,合成与细胞免疫及体液免疫相关抗原表位肽基因:21-40肽（20AA）和141-160肽（20AA）基因序列,运用基因工程技术构建了含有串联结构21-40（20AA）～141-160（20AA）～21-40（20AA）～141-160（20AA）的2020-2020 VP1融合基因表达载体r2020-2020。表达载体转化宿主菌BL21（DE3）RIL后诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Western Blot分析显示重组融合蛋白的分子量约为18kD。融合蛋白免疫兔与豚鼠,对免疫动物血清及脾脏淋巴细胞进行免疫学分析。采用MTT法测定免疫豚鼠脾脏淋巴细胞增值情况,结果表明,较小剂量的融合蛋白就能诱导豚鼠产生特异性T淋巴细胞增殖反应;采用细胞中和及乳鼠保护实验测定免疫豚鼠血清中FMDV中和抗体水平,结果表明融合蛋白能够诱导豚鼠产生中和抗体,证明该融合蛋白可同时激活细胞免疫及体液免疫反应,具有开发成为抗FMDV疫苗的应用价值。 肠毒素大肠杆菌（ETEC）是引起仔猪腹泻的主要致病菌,产生的肠毒素主要为热敏性肠毒素（LT）与耐热性肠毒素（ST）。本论文运用基因工程技术构建了含有肠毒素大肠杆菌（ETEC）LTB、STI基因及双拷贝2020 VP1的融合表达载体r2020～B～2020～STI,转化宿主菌BL21（DE3）RIL后的表达产物经SDS～PAGE分析,结果显示重组融合蛋白的分子量约为45kD,表达量较高。纯化的融合蛋白能够与霍乱毒素（cholera toxin）CTB抗体特异结合。动物实验表明,融合蛋白能够诱发兔体产生较强的抗FMDV中和抗体,免疫豚鼠在低浓度FMDV刺激下能够产生特异性T淋巴细胞增殖反应,说明融合蛋白具有较好的体液免疫及细胞免疫原性,可以诱导机体产生有效的抗FMDV细胞及体液免疫反应;同时,融合蛋白免疫老鼠能够抵抗大肠杆菌强毒株攻击,免疫兔体能够产生STI中和抗体,且融合蛋白不具STI毒性,证明融合蛋白具有良好的LTB、STI免疫原性。实验结果表明,此融合蛋白具有开发成为抗FMDV及肠毒素大肠杆菌疫苗的应用价值。

论文目录

• 摘要
• Absract
• 前言
• 第一部分 O型口蹄疫病毒VP1 T细胞与B细胞表位基因双拷贝串联表达产物的免疫应答
• 第一章 口蹄疫病毒研究进展
• 1.1 口蹄疫病毒分子生物学特征
• 1.1.1 口蹄疫病毒基因组结构
• 1.1.2 口蹄疫病毒基因表达
• 1.1.3 口蹄疫病毒结构蛋白及其功能
• 1.1.4 FMDV非结构蛋白及功能
• 1.1.5 FMDV的变异性
• 1.2 口蹄疫病毒的复制与感染
• 1.2.1 FMDV感染细胞的机制
• 1.2.2 FMDVRNA的合成
• 1.2.3 FMDV的翻译
• 1.2.4 病毒颗粒的包装
• 1.2.5 病毒的病原性
• 第二章 实验部分
• 2.1 表达载体构建
• 2.1.1 试验材料与溶液配制
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.2.1 表达载体构建的策略
• 2.1.2.2 表达载体pET30a
• 2.1.2.3 质粒的提取
• 2方法）'>2.1.2.4 感受态细胞的制备（CaCl₂方法）
• 3.1.2.5 质粒的转化
• 2.1.2.6 目的基因片段的获得
• 2.1.2.7 2020VP1基因的PCR扩增与克隆
• 2.1.2.8 载体和目的片段的回收、双酶切与连接
• 2.1.2.9 重组质粒的鉴定
• 2.1.3 实验结果
• 2.2 pET30a-2020-2020的表达及蛋白鉴定
• 2.2.1 实验材料及溶液配制
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.2.1 重组表达载体pET30a-2020-2020的表达
• 2.2.2.2 表达蛋白的SDS-PAGE电泳
• 2.2.2.3 凝胶的考马斯亮蓝染色及脱色
• 2.2.2.4 免疫印迹
• 2.2.3 实验结果
• 21（DE₃）RIL表达'>2.2.3.1 pET30a-2020-2020/BL₂₁（DE₃）RIL表达
• 2.2.3.2 免疫印迹
• 2.3 重组蛋白r2020-2020的纯化
• 2.3.1 实验材料及溶液配制
• 2.3.2 实验方法
• 2.3.2.1 发酵
• 2.3.2.2 重组蛋白r2020-2020变性
• 2.3.2.3 重组蛋白的纯化
• 2.3.2.4 纯化蛋白的复性
• 2.3.3 实验结果
• 2.4 重组蛋白r2020-2020的定量及ELISA
• 2.4.1 实验材料及溶液配制
• 2.4.2 实验方法
• 2.4.2.1 纯化蛋白质的定量
• 2.4.2.2 ELISA检测r2020-2020蛋白与FMDV疫苗免疫动物血清的结合活性
• 2.4.3 实验结果
• 2.4.3.1 蛋白质浓度
• 2.4.3.2 ELISA反应结果
• 2.5 动物免疫及免疫动物血清抗体监测
• 2.5.1 实验材料及试剂
• 2.5.2 实验方法
• 2.5.2.1 r2020-2020免疫物的制备
• 2.5.2.2 动物免疫
• 2.5.2.3 免疫后兔血清抗体增长情况
• 2.5.3 实验结果
• 2.6 免疫豚鼠T细胞增殖实验
• 2.6.1 实验材料及溶液配制
• 2.6.2 实验方法
• 2.6.2.1 FMDV抗原制备
• 2.6.2.2 MTT法检测T细胞增殖
• 2.6.3 实验结果
• 2.7 豚鼠血清的细胞中和实验
• 2.7.1 实验材料
• 2.7.2 细胞中和实验
• 2.7.3 实验结果
• 2.8 豚鼠血清乳鼠保护实验
• 2.8.1 实验材料
• 2.8.2 实验方法
• 50'>2.8.2.1 FMDV对乳鼠的LD₅₀
• 2.8.2.2 豚鼠血清对乳鼠的保护
• 2.8.3 实验结果
• 2.9 讨论
• 参考文献
• 第二部分：O型FMDV VP1T细胞与B细胞表位双拷贝基因与肠毒素大肠杆菌LTB、STI肠毒素基因融合表达产物的免疫应答
• 第一章 肠毒素大肠杆菌热敏性肠毒素研究进展
• 1.1 LT的理化性质和生物学功能
• 1.1.1 LI理化性质
• 1.1.2 LT生物学功能
• 1.2 LT免疫原性研究
• 1.2.1 LT免疫原性表位
• 1.2.2 LT的免疫应答机理
• 1.2.3 LT免疫原性应用
• 1.3 LT免疫佐剂作用
• 1.3.1 LT佐剂类型
• 1.3.2 LT的佐剂作用
• 1.3.3 LT佐剂作用的应用
• 第二章 肠毒素大肠杆菌热稳定性肠毒素研究进展
• 2.1 ST理化性质
• 2.2 ST的生物学功能
• 2.3 ST的免疫原性研究
• 第三章 实验部分
• 3.1 表达载体构建
• 3.1.1 试验材料与溶液配制
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.2.1 表达载体构建的策略
• 3.1.2.2 pET32a表达载体
• 3.1.2.3 质粒提取，感受态细胞制备，转化
• 3.1.2.4 目的基因片断的获得
• 3.1.2.5 目的片断的回收、酶切、连接
• 3.1.2.6 重组表达载体的鉴定
• 3.1.3 实验结果
• 3.1.3.1 pET32a—2020a鉴定
• 3.1.3.2 pET32a—2020a—LTB-STI鉴定
• 3.1.3.3 pET32a—2020—LTB-2020-STI鉴定
• 3.2 重组蛋白表达
• 3.2.1 实验材料及溶液配制
• 3.2.3 实验方法
• 3.2.3 实验结果
• 3.2.3.1 pET32a—2020a重组蛋白的表达
• 3.2.3.2 pET32a-2020a-LTB-STI重组蛋白的表达
• 3.2.3.3 pET32a-2020-LTB-2020-STI重组蛋白的表达
• 3.3 pET32a-2020-LTB-2020-STI重组蛋白的纯化及动物免疫
• 3.3.1 实验材料及溶液配置
• 3.3.2 实验方法
• 3.3.2.1 蛋白纯化、复性及抗原制备
• 3.3.2.2 动物免疫
• 3.3.3 实验结果
• 3.4 融合蛋白pET32a-2020-LTB-2020-STI的LTB免疫原性ELISA检测
• 3.4.1 实验材料及溶液配置
• 3.4.2 实验方法
• 3.4.2.1 实验思路
• 3.4.2.2 ELISA方法
• 3.4.3 实验结果
• 3.5 融合蛋白pET32a-2020-LTB-2020-STI的STI毒性测定
• 3.5.1 实验材料
• 3.5.2 实验方法
• 3.5.3 实验步骤
• 3.5.4 实验结果
• 3.6 大肠杆菌强毒株攻击免疫动物实验
• 3.6.1 实验材料
• 3.6.2 实验方法
• 3.6.2.1 最小致死量测定（MLD）
• 3.6.2.2 攻击实验
• 3.6.3 实验结果
• 3.7 免疫动物血清对STI毒素的中和实验
• 3.7.1 实验材料
• 3.7.2 实验方法
• 3.7.2.1 STI一个鼠活性单位测定
• 3.7.2.2 中和实验
• 3.7.3 实验结果
• 3.7.3.1 STI一个鼠活性单位测定
• 3.7.3.2 免疫血清中和STI实验
• 3.8 细胞中和实验测定免疫动物血清抗口蹄疫病毒滴度
• 3.8.1 实验材料
• 3.8.2 实验方法
• 3.8.3 实验结果
• 3.9 乳鼠保护实验
• 3.9.1 实验材料及动物
• 3.9.2 实验方法
• 3.9.3 实验结果
• 3.10 豚鼠T淋巴细胞增值实验
• 3.10.1 实验材料及溶液配置
• 3.10.2 实验方法
• 3.10.2.1 实验原理
• 3.10.2.2 FMDV抗原制备
• 3.10.2.3 XTT方法测定免疫豚鼠T淋巴细胞增值
• 3.10.3 实验结果
• 3.11 讨论
• 参考文献
• 致谢