血管基膜衍生多功能肽高效工程菌的构建及人肺癌裸鼠移植瘤模型治疗实验

论文摘要

研究背景:我们采用整合抑制肿瘤血管生成和抑制肿瘤细胞增殖策略,将肿瘤抑素（tumstatin）N端74-98氨基酸功能肽通过人IgG3上游铰链区序列与tumstatin N端197-215氨基酸功能肽连接,获得了一种全新的同时具有抑制血管内皮细胞增殖和抑制肿瘤细胞增殖两种不同抗肿瘤特性的血管基膜衍生多功能肽（Vascular basement membrane-derived multifunctional peptide, VBMDMP）。本课题是在此基础上构建重组VBMDMP同型四聚体可溶性融合蛋白高丰度原核表达质粒pET SUMO—4VBMDMP,转化入BL21（ED3）大肠杆菌获得重组VBMDMP高效工程菌;通过重组VBMDMP裸鼠人肺癌异种移植瘤模型治疗实验评价重组VBMDMP治疗肿瘤的有效性.为重组VBMDMP产业化奠定基础。 方法:将原pUC19-VBMDMP和pUC19质粒分别用Hind Ⅲ和Kpn Ⅰ酶切获得VBMDMP cDNA片段和pUC 19 cDNA片段,将两者连接后得到新单聚体pUC19-VBMDMP;酶切图谱和测序鉴定后,将新单聚体pUC19-VBMDMP用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切获得VBMDMP cDNA片段,用Bcl Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切获得载体cDNA片段,将分别获得的两个片断连接得到pUC19-2VBMDMP,重复以上步骤得pUC19-4VBMDMP;分别酶切图谱和测序鉴定pUC19-2VBMDMP和pUC19-4VBMDMP。测序后以pUC19-4VBMDMP为模板,T/A克隆构建重组pET SUMO—4VBMDMP。重组pET SUMO—4VBMDMP原核表达质粒转化入BL21（ED3）大肠杆菌,IPTG诱导表达4小时,镍亲和层析柱分离纯化,得重组4VBMDMP融合蛋白。同时,用针对tumstatin N端197-215氨基酸功能肽的多克隆抗体,Western blot分析对重组4VBMDMP进行免疫鉴定。BCA法分别测定pET SUMO—4VBMDMP转化的BL21（ED3）大肠杆菌裂解液和镍亲和层析后获取的等容积洗脱液蛋白质含量,评价pET SUMO—4VBMDMP转化的BL21（ED3）大肠杆菌生产重组VBMDMP的效率。最后应用裸鼠人肺癌异种移植瘤模型治疗实验鉴定重组VBMDMP抗肿瘤活性。

论文目录

• 一、中文摘要
• 二、英文摘要
• 三、主要英文缩略语
• 四、论文正文
• 前言
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 参考文献
• 五、综述
• 六、致谢
• 七、附录