论文摘要
肝癌是我国常见的高发恶性肿瘤,其发生发展是一个多因素、多步骤和多基因参与的过程。迁移性和侵入性是癌细胞的重要生物学特性,了解癌细胞迁移的机制,将为控制癌细胞迁移扩散及癌症的治疗提供新的思路和方法。RhoA是近年来新发现的与多种恶性肿瘤密切相关的癌基因,RhoA属于Rho亚家族,是ras基因超家族的一员,其编码产物RhoA蛋白属于小分子量GTP结合蛋白族（小G蛋白）,分为GTP结合的活性型和GDP结合的非活性型两类,在正常细胞内以GDP结合的非活性型存在,两种活性形式之间的转换使他们能够发挥一种类似“分子开关”的作用,活性态的小G蛋白能激活下游的信号传导通路,行使其功能。与Ras基因突变导致其持续激活相似,Rho基因若发生结构改变,使GTP水解发生障碍,而处于持续GTP结合的激活状态,可致其多种功能增强,称为组成型激活突变体,如RhoA（G14V）、RhA（Q63L）等。Rho家族蛋白参与调节了细胞的多种生命过程,包括肌动蛋白的细胞骨架重组、细胞黏附、细胞运动、细胞周期进展、细胞分裂以及基因转录等,已经发现的RhoA的下游效应分子包括ROCK、PKN、Citron及PI-3K等,这些分子介导了RhoA的作用。因此,小G蛋白被认为是细胞迁移的关键信号蛋白。cAMP是重要的第二信使,蛋白激酶A（Protein Kinase A,PKA）是cAMP依赖的蛋白激酶,它介导cAMP的信号转导。如PKA在细胞骨架调节和细胞迁移中扮演着重要角色。最近发现,PKA能抑制RhoA的功能。溶血磷脂酸（Lysophosphatidic acid,LPA）是由血小板、成纤维细胞、癌细胞和脂肪细胞分泌,是一种多功能的“磷脂信使”,为了应答多种细胞外刺激,LPA也可以从多种类型的细胞释放,包括损伤的内皮因子、活化的成纤维细胞、肾系膜细胞、炎性细胞都可产生LPA,以自分泌、旁分泌形式产生细胞效应,这决定了LPA的多种生物学效应与多种疾病的密切关系。在多种重大疾病如心脑血管病、肾病、肿瘤的发生、发展中起着重要作用。研究发现LPA可刺激RhoA活性。在本实验中,我们利用HepG2细胞为肝细胞肝癌细胞株的典型代表,L-O2为正常肝细胞的代表,研究RhoA在上述细胞的表达情况,并用RhoA激动剂和拮抗剂作用于上述细胞,观察RhoA对癌细胞迁移活动的影响。目的:检测RhoA在HepG2细胞及L-O2细胞的表达;通过激动和拮抗RhoA的功能,观察癌细胞的迁移情况,探讨RhoA在调控肝癌细胞迁移过程中的作用,为进一步研究肝癌细胞转移机制提供可行性及初步的实验依据。方法:以人肝细胞肝癌（hepatocelluar carcinoma,HCC）细胞株HepG2及正常肝细胞株L-O2为研究对象,在完全、高糖DMEM培养基（含10%胎牛血清）中培养,倒置显微镜下观察其形态,对数生长期行HE染色;用SABC法免疫细胞化学检测RhoA蛋白在HepG2细胞及L-O2细胞中的表达,应用生物医学图像分析系统对免疫细胞化学图片染色图像进行体视学分析,得出平均光密度;用Millicell小室检测HepG2细胞及L-O2细胞的侵袭能力,分别加入激动剂与拮抗剂培养4h后检测细胞迁移数。实验所得数据以均数±标准差（±s）表示;数据分析采用SPSS10.0软件,t检验, P<0.05表示有统计学意义。结果:（1）形态学观察:HepG2细胞及L-O2细胞在对数生长期生长状况良好,透明度大,折光性好,轮廓模糊,可见许多分裂期细胞;（2）细胞爬片免疫细胞化学示L-O2细胞RhoA蛋白表达非常微弱,几乎难以染色,而HepG2细胞RhoA蛋白呈强阳性表达,其阳性产物呈棕黄色,分布于胞浆。图像分析免疫细胞化学细胞爬片平均光密度L-O2细胞:0.092±0.010;HepG2细胞:0.398±0.018;两者的平均光密度经统计学分析有显著的差异（P<0.05）;（3）Millicell小室检测,HepG2细胞通过细胞小室虑孔的细胞比L-O2细胞明显增多;HepG2细胞在加入LPA后通过细胞小室虑孔的细胞显著增多;而在加入cAMP后通过细胞小室虑孔的细胞显著减少。分别随机取20个高倍视野计数通过细胞小室虑孔的细胞数,L-O2细胞:74.30±5.60;HepG2细胞:131.40±7.26;两者经统计学分析有显著的差异（P<0.05）;HepG2细胞+LPA:192.00±7.59;HepG2细胞+cAMP:65.10±4.61;两者经统计学分析有显著的差异（P<0.05）。结论:RhoA蛋白在HepG2及L-O2两株细胞中均有表达,但肝癌细胞株HepG2的表达量远远高于正常细胞株L-O2;通过Millicell小室检测,发现HepG2细胞通过细胞小室虑孔的细胞比L-O2细胞明显增多;HepG2细胞在加入RhoA激动剂后通过细胞小室虑孔的细胞显著增多;HepG2细胞在加入RhoA拮抗剂后剂通过细胞小室虑孔的细胞显著减少。提示RhoA可能是肝癌发生及转移的一个重要因素。