拟南芥PPR蛋白EMS15功能的初步研究

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拟南芥（Arabidopsis thaliana）白化突变体ems15经EMS化学诱变法得到。遗传分析表明该突变株系为核基因控制的单基因隐性突变。突变体的表型为植株白化，苗期致死。叶绿体超微结构分析显示ems15突变体的叶绿体空泡化严重，几乎不含类囊体片层结构。利用图位克隆和基因测序分析发现AT4G18520发生了终止突变，经遗传互补及等位分析确认了AT4G18520突变导致了ems15的白化突变表型。EMS15基因编码的蛋白是一个PPR蛋白家族成员，其蛋白序列中间包含包括P、L、S在内的14个连续的PPR基序，属于PLS亚家族。亚细胞定位显示该蛋白定位于叶绿体中。序列比对及进化分析表明该蛋白在不同物种中均有其同源物，进化上比较保守。利用RT-PCR和Real-Time PCR分析该基因的表达模式发现该基因在根、茎、叶、花和幼苗中均有表达，而在叶中的表达量最高。已知多数PPR蛋白参与对质体基因的表达调控。为了探究EMS15基因对叶绿体基因表达的影响，我们利用RT-PCR分析EMS15对叶绿体中前体mRNA内含子剪接的影响，结果显示部分叶绿体基因如trnK、petB、petD等的内含子剪接效率明显低于野生型。同时我们也检测了EMS15对叶绿体多顺反子的切割情况，发现EMS15对叶绿体基因组编码的RNA聚合酶（PEP）亚基rpoA的切割效率明显下降。EMS15可能参与叶绿体基因表达的多种调控过程，其中的分子机理尚需进一步研究。

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1.引言

1.1 叶绿体起源学说

1.1.1 内共生起源学说

1.1.2 非共生起源学说

1.2 叶绿体的发生、结构与功能

1.2.1 叶绿体的发生

1.2.2 叶绿体的形态结构与功能

1.3 拟南芥叶绿体基因组结构与表达调控

1.3.1 拟南芥基因组中的多顺反子

1.3.2 拟南芥叶绿体基因组中依赖NEP 和依赖PEP的基因

1.3.3 叶绿体基因组中的内含子

1.4 PPR蛋白家族

1.4.1 PPR 家族蛋白的特征

1.4.2 PPR 蛋白家族的分类

1.4.3 PPR 基因的分布

1.4.4 PPR 蛋白在细胞中的定位分布分析

1.4.5 PPR 蛋白的分子功能

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 主要仪器

2.1.3 菌株、质粒

2.1.3.1 菌株

2.1.3.2 质粒载体

2.1.4 抗生素

2.1.5 培养基配方

2.1.6 其它

2.2 实验方法

2.2.1 拟南芥种植、转化与转基因植株的筛选

2.2.1.1 拟南芥无菌培养

2.2.1.2 拟南芥土壤种植与农杆菌转化

2.2.1.3 转基因植株的筛选

2.2.2 T-DNA 插入突变体的鉴定

2.2.3 热击感受态E.coli 制备

2.2.4 大肠杆菌的转化

2.2.5 制备农杆菌感受态细胞

2.2.6 农杆菌的转化过程

2.2.7 克隆后载体的鉴定

2.2.8 质粒DNA 的少量制备碱裂解法

2.2.9 小量酶切鉴定体系

2.2.10 连接片段或载体的体系

2.2.11 载体构建

2.2.11.1 互补载体的构建

2.2.11.2 亚细胞定位载体的构建

2.2.12 DNA 和RNA 的抽取

2.2.12.1 DNA 的抽取

2.2.12.2 RNA 的抽取

2.2.13 RT-PCR 和Real-Time PCR

2.2.13.1 RNA 反转录合成cDNA 第一链

2.2.13.2 半定量PCR

2.2.14 原生质体导入亚细胞定位GFP 载体方法

2.2.15 透射电镜观察

2.2.16 免疫印迹杂交(Western Blot

2.2.17 RNA 印迹杂交(Northern Blot

3.结果与讨论

3.1 拟南芥白化突变体ems15 及等位分析

3.2 ems15突变体的遗传互补实验

3.3 ems15突变体的表型分析

3.4 ems15突变体的超微结构分析

3.5 EMS15序列分析和蛋白质的亚细胞定位

3.6 EMS15蛋白定位于叶绿体中

3.7EMS15基因的表达模式

3.8 EMS15表达产物对叶绿体基因内含子剪切的影响

3.9 EMS15对叶绿体多顺反子前体RNA 裂解的影响

3.10 EMS15 对叶绿体蛋白的影响

3.11 讨论

3.11.1 EMS15基因是拟南芥叶绿体的正常发生与发育的必需基因

3.11.2 EMS15是PPR 蛋白家族的成员

3.11.3 EMS15突变影响多顺反子中pro-rpoA 的正常裂解

参考文献

致谢

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