月季RcHSP17.8基因克隆与功能研究

论文摘要

月季（Rosa chinensis）为蔷薇属中能连续开花的观赏花卉植物,在园林绿化领域中享有极高的声誉,深受人们喜爱。由于全球“温室效应”现象日益明显,高温已成为制约植物生长和发育的主要环境因子,月季的生长发育也面临着高温逆境的严峻挑战,因此,如何提高月季对高温等逆境胁迫的抗性研究意义重大。高质量基因组DNA、总RNA的有效提取是月季分子生物学研究基础。月季富含单宁、多糖、酚等次生代谢物,严重影响其DNA、RNA的提取。本文通过对经典CTAB法的改进而获得高质量的月季DNA;筛选到植物RNAout试剂盒较适合月季总RNA提取;为了获得大量的实验材料,本文还建立了有效的月季快速繁殖体系。本文筛选到两个耐热性差异明显的月季品种:耐热的‘曼海姆宫殿’（SM）与不耐热的‘新十全’（KP）。38℃/3h热激后经双向电泳,获得SM在高温下差异表达的蛋白质点。经肽质谱分析,初步推定该蛋白质点与拟南芥小分子热激蛋白HSP17.5同源性高。同源克隆获得251bp的片段,根据序列设计3对反式PCR引物,以SM热激后的cDNA为模板,采用反式PCR获得基因5’端序列,应用3’-RACE获得基因3’端序列。再以5’、3’端序列设计引物,PCR扩增获得基因的开放阅读框（ORF）,全长465bp,包含154个氨基酸,命名为RcHSP17.8（登录号:EF053229）。BLAST检索显示它与其它物种小分子热激蛋白基因（sHSP）具有较高同源性,氨基酸序列比对发现其包含胞质Ⅰ类sHSP的特征保守序列,聚类分析显示它位于双子叶植物胞质Ⅰ类sHSP区域,该基因属胞质Ⅰ类sHSP基因。Southern杂交表明该基因在月季基因组中为低拷贝存在。月季RcHSP17.8为温度诱导表达基因,38℃热激5min就能检测转录子,5h后表达量开始下降。热激下,该基因在花中的表达量明显高于其它器官,推测RcHSP17.8可能与花发育有关。此外,NaCl、PEG4000、蔗糖、H2O2等胁迫均能诱导RcHSP17.8表达,证明RcHSP17.8参与月季对高盐、高渗、氧化等非生物胁迫的响应。构建原核表达载体pET32a-RcHSP 17.8转化大肠杆菌BL21,SDS-PAGE结果显示,转化菌株在IPTG诱导下0.5h就可检测到含RcHSP17.8的融合蛋白。Western印迹显示在37℃常温下IPTG诱导0.5h转pET32a-RcHSP17.8菌株就表达目的融合蛋白,2h达最大值,6h后表达量开始下降;50℃高温胁迫下,0.5h时转化菌株就开始高表达目的蛋白,5h时还维持很高表达量。上述实验结果表明转化菌株在常温下能正常表达RcHSP17.8的融合蛋白,而高温引起其表达量增高。抗性胁迫实验证明RcHSP17.8的转入提高了大肠杆菌对高温、低温、高盐、高pH、重金属、氧化等非生物胁迫的耐性。构建酵母真核表达载体pPIC3.5K-YEP-RcHSP17.8,经BglⅡ线性化后采用电击法转化酵母SMD1168,通过G418筛选获得多拷贝阳性克隆菌株。共定位显微观察显示YEP只在胞质中表达,结果表明同源重组的酵母能正常表达含有目的基因的融合蛋白,且定位在细胞质,这与RcHSP17.8属胞质Ⅰ类sHSP的推理相吻合。同源重组酵母在50℃高温、4℃低温下的菌落生长状况明显好于空载转化酵母,表明RcHSP17.8基因的转入提高了酵母对高温与低温的耐受性。此外,转化后的酵母提高了对高盐、高pH、重金属、氧化等非生物胁迫的抗性。构建重组植物表达载体PHB-RcHSP17.8,通过农杆菌介导将RcHSP17.8基因转入拟南芥,经潮霉素筛选获得T3代转基因种子。Western blot结果显示转基因植株高表达RcHSP17.8;对培养基上生长的株系,进行高温、高盐、高渗处理,发现转基因拟南芥平均根长与存活率均优于野生型拟南芥;对盆栽苗进行干旱处理,发现转基因株系具有较强的抗旱性。RT-PCR检测发现,转基因株系在胁迫时高表达RcHSP17.8,同时还发现一些与胁迫相关的基因,如HSP101、渗调蛋白基因（Osmotin）、甜菜碱醛脱氢酶基因（BADH）、脯氨酸合成酶基因（P5CS）、抗坏血酸过氧化物酶基因（APX）相应高或低表达,证明RcHSP17.8在胁迫条件下与HSP101协同行使了分子伴侣功能,并保护了上述蛋白或酶,从而提高了转基因拟南芥多种胁迫抗性。上述研究结果表明,在胁迫条件下,月季RcHSP17.8基因过表达导致其宿主体内RcHSP17.8的积累,从而提高了宿主对高温、低温、高盐、高渗、高pH、重金属、氧化等多种非生物胁迫的耐受性,证明RcHSP17.8参与了多种非生物胁迫的响应。应用反式PCR获得SM与KP的RcHSP17.8基因启动子,序列比对发现它们在顺式调控元件上存在一些差异,具有高温、低温、ABA、真菌病害等诱导顺式作用元件。启动子克隆与序列初步分析旨在探索月季RcHSP17.8响应多种非生物胁迫的分子机理。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 植物热激蛋白的研究进展及月季抗性研究状况与意义
• 1 植物热激蛋白的研究状况
• 1.1 植物热激蛋白的产生与类型
• 1.2 植物热激蛋白的功能
• 1.3 植物小分子热激蛋白功能及研究进展
• 2 植物热激蛋白基因启动子的研究现状与意义
• 2.1 植物启动子的结构与特征
• 2.2 克隆植物启动子的方法
• 2.3 植物启动了的类型及应用研究
• 2.4 小分子热激蛋白基因启动子的研究进展
• 3 月季的研究状况及其抗性研究意义
• 3.1 月季介绍
• 3.2 月季的研究状况
• 3.3 月季抗性研究意义
• 参考文献
• 第二章 月季分子生物学研究技术平台的建立
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 月季基因组DNA提取
• 2.2 月季总RNA提取与检测
• 2.3 月季快速繁殖体系的建立
• 3 结果与讨论
• 3.1 DNA检测
• 3.2 RNA检测
• 3.3 月季快繁体系的评价
• 小结
• 参考文献
• 第三章 月季RcHSP17.8基因克隆与功能研究
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 月季RcHSP17.8基因克隆
• 2.2 月季RcHSP17.8基因诱导表达模式
• 2.3 RcHSP17.8基因的原核表达
• 2.4 RcHSP17.8在酵母中真核表达
• 2.5 转基因拟南芥综合评价
• 3 结果与讨论
• 3.1 RcHSP17.8基因克隆与序列分析
• 3.2 月季RcHSP17.8基因诱导表达模式
• 3.3 RcHSP17.8基因的原核表达
• 3.4 RcHSP17.8基因在酵母中真核表达
• 3.5 转基因拟南芥综合评价
• 小结
• 参考文献
• 第四章 月季RcHSP17.8启动子克隆与序列分析
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 RcHSP17.8基因启动子克隆
• 2.2 RcHSP17.8基因启动子序列初步分析
• 3 结果与讨论
• 3.1 反式PCR克隆RcHSP17.8基因启动子
• 3.2 启动子序列分析
• 小结
• 参考文献
• 发表论文
• 专利申请
• 致谢