牛γ干扰素基因克隆和表达及多克隆抗体制备

论文摘要

牛γ干扰素具有较强的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用,作为生物药剂和疫苗佐剂具有广阔的应用前景。本试验成功地克隆、表达和纯化了BoIFN-γ,并制备了兔抗BoIFN-γ的多克隆抗血清,为BoIFN-γ生物学特性及其应用研究奠定了基础。本研究采用刀豆蛋白A刺激牛脾脏淋巴细胞总RNA,设计合成特异引物,采用反转录聚合酶链式反应（Reverse Transcriptase-PCR,RT-PCR）技术扩增和克隆BoIFN-γ基因,与pMD18-T载体连接后进行酶切、PCR以及序列测定和分析。结果表明,所克隆的BoIFN-γ基因全长498bp,编码166个氨基酸,与GenBank发布的羊、猪、人、鼠和鸡的IFN-γ核苷酸序列进行比较,其同源率分别为81.3%、74.9%、73.6%、53.7%和50.7%。与GenBank上发布的其它BoIFN-γ基因核苷酸序列进行比较,其同源率为100%。将BoIFN-γ基因亚克隆到表达载体pET-30a（+）中,构建重组表达质粒pET-BoIFN-γ并转化大肠杆菌BL21,于37℃经0.5mmol/L IPTG诱导表达6h,SDS-PAGE和Western blot分析表明BoIFN-γ基因在大肠杆菌中获得了高水平表达,表达的融合蛋白以分子量约为25ku,且表达产物占菌体总蛋白的35%。利用镍离子亲和树脂进行纯化得到纯化的目的蛋白浓度为1.6mg/ml,将纯化蛋白免疫新西兰白兔,制备了BoIFN-γ多克隆抗血清,经琼脂扩散实验和Western blot鉴定证明所得到的多克隆抗血清与表达的融合蛋白具有良好的免疫反应性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 IFN 研究概况
• 1.1.1 IFN 来源
• 1.1.2 IFN 分类及基因结构
• 1.1.3 IFN 主要生物学功能
• 1.1.4 IFN 诱生
• 1.1.5 IFN 作用特点
• 1.1.6 IFN 抗病毒机理
• 1.1.7 IFN 基因工程研究
• 1.2 IFN-γ研究概况
• 1.2.1 IFN-γ诱生
• 1.2.2 IFN-γ结构
• 1.2.3 IFN-γ受体和作用机制
• 1.2.4 IFN-γ生物学活性
• 1.2.5 IFN-γ应用
• 1.2.6 存在的问题和展望
• 1.3 研究目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 菌株和载体
• 2.1.3 工具酶和试剂
• 2.1.4 引物
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 BoIFN-γ基因的克隆与序列分析
• 2.2.2 BoIFN-γ基因表达载体的构建
• 2.2.3 BoIFN-γ基因的表达及蛋白纯化
• 2.2.4 融合蛋白的免疫原性研究
• 3 结果
• 3.1 BoIFN-γ基因的克隆与序列分析
• 3.1.1 细胞培养及总RNA 的提取
• 3.1.2 RT-PCR
• 3.1.3 重组质粒的鉴定
• 3.1.4 BoIFN-γ 核苷酸序列的测定结果与分析
• 3.2 BoIFN-γ 基因表达载体的构建
• 3.3 BoIFN-γ 基因的表达和蛋白纯化
• 3.4 融合蛋白的免疫原性研究
• 4 讨论
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文