论文摘要
目的构建BMP-2活性肽/PLGA-[ASP-PEG]仿生骨基质材料,评价BMP-2活性肽对大鼠骨髓基质干细胞（BMSC）的粘附、增殖及诱导成骨分化的影响。方法对聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）改性,制成PLGA-[ASP-PEG]多元共聚物,同时用固相合成法合成寡肽BMP-2活性肽（P24）,将其与PLGA-[ASP-PEG]共价结合,构建BMP-2活性肽（P24）/ PLGA-[ASP-PEG]仿生骨基质支架材料。实验分三组,将大鼠BMSC与不同材料复合培养。A组为PLGA-[ASP-PEG]仿生骨基质材料,B组为PLGA-[ASP-PEG]材料,C组为单纯的PLGA材料。流式细胞仪（FCM）对培养细胞性质进行鉴定。沉淀法测定细胞与材料到粘附率。四甲基偶氮唑蓝微量酶反应比色法（MTT）、考马斯亮蓝法和扫描电镜（SEM）检测BMSC体外增殖活性,成骨诱导标志物碱性磷酸酶（ALP）活性,骨钙蛋白（OCN）含量,ALP染色和钙结节染色了解BMSC成骨分化情况。结果FCM证实分离培养的细胞为BMSC。细胞粘附率检测显示,BMSC在P24/ PLGA-[ASP-PEG]材料表面和PLGA-[ASP-PEG]材料表面的粘附性能和增殖能力明显高于PLGA表面,差异有统计学意义（P<0.05）。与SEM、细胞生长曲线和细胞蛋白质含量测定结果一致。ALP活性和OCN含量检测显示:P24诱导的A组ALP活性和OCN含量明显高于B组和C组,ALP染色和钙结节染色:P24诱导的A组出现阳性表现的时间最早。结论PLGA-[ASP-PEG]能促进BMSC在骨基质材料表面的粘附、增殖并能较好地保持细胞的形态,PLGA-[ASP-PEG]材料及其降解产物不影响BMSC的成骨分化, P24能体外诱导BMSC向成骨方向分化,具有与BMP-2类似的骨诱导活性。第二部分BMP-2活性肽体外定向诱导大鼠BMSC向成骨方向分化的剂量依赖性研究目的探讨自行合成的寡肽P24对大鼠BMSC体外定向诱导成骨分化的能力,评价P24的成骨诱导活性及体外诱导成骨的最佳剂量。方法取4周龄SD大鼠分离培养BMSC,传至第3代时改用成骨诱导培养基,培养基中分别加入浓度为300、200、100、50和0μg/ml的P24,并依次记为A、B、C、D和E组。观察细胞的形态学改变,检测细胞的ALP活性和OCN含量,实时荧光定量RT-PCR检测成骨标志物基因Ⅰ胶原（COL-Ⅰ）、骨桥蛋白（OPN）及OCN mRNA的表达。结果倒置相差显微镜下观察,用成骨诱导培养基培养3～4d,培养细胞形态由长梭形转变为短梭形或多角形。随着培养基中P24浓度的增加,细胞发生成骨样改变的时间提前。ALP活性和OCN含量检测显示,A和B组ALP活性和OCN含量较其他三组增加明显,差异有显著性（P<0.05）,组间比较,差异无显著性（P>0.05）。实时荧光定量RT-PCR检测显示培养14d,成骨诱导标志物COL-Ⅰ、OPN和OCN mRNA在各组均有表达。A组和B组的Ct值明显大于C组和D组,差异有显著性（P<0.05）,但A组和B组之间差异无显著性（P>0.05）。结论P24体外能有效地诱导BMSC向成骨方向分化,在PLGA-[ASP-PEG]材料体系中,最适合的P24体外诱导剂量认为是200μg/ml。第三部分BMP-2活性肽/PLGA-[ASP-PEG]仿生骨基质材料异位成骨的实验研究目的评价P24/PLGA-[ASP-PEG]仿生骨基质材料的异位成骨能力。方法成年雄性SD大鼠48只,随机分成三组,分别在大鼠背部双侧竖脊肌浅层肌袋中植入不同材料。A组:P24/ PLGA-[ASP-PEG]仿生骨基质材料;B组:单纯PLGA-[ASP-PEG]材料;C组:单纯的明胶海绵材料。X线、CT+三维成像观察植入物成骨情况,不同时间点病理切片,行组织学观察,western blot检测植入区成骨标志物Col-I及OPN蛋白的表达,实时荧光定量RT-PCR检测Col-I及OPN mRNA的表达。结果X线、CT+三维成像:8周时,A组可见明显的成骨表现,B组偶见成骨样影像,C组未见新骨表现。组织学观察:A组8周骨小梁明显增粗增宽,表面形成类骨密质的结构,可见大量新骨形成,在新骨外周部有骨小梁及新生血管。B组8周时植入区纤维组织增生,偶见软骨细胞及少量成骨细胞。C组8周明胶海绵吸收,呈现肌肉组织表现,未见新骨形成。实时荧光定量RT-PCR:各组8周均有Col-I mRNA和OPN mRNA的表达, A组中Col-I mRNA和OPN mRNA为高表达。与western blot检测结果一致。结论构建的P24/PLGA-[ASP-PEG]仿生骨基质材料能够诱导异位成骨,P24具有与天然BMP-2类似的异位诱导成骨能力和骨诱导活性,其成骨过程以软骨内化骨为主。第四部分BMP-2活性肽/PLGA-[ASP-PEG]仿生骨基质材料修复兔股骨缺损的实验研究目的探讨P24/PLGA-[ASP-PEG]仿生骨基质材料修复兔股骨中段临界大小骨缺损的可行性。方法36只新西兰大白兔制备成股骨中段15mm的临界大小骨缺损模型。按实验设计分为三组。A组:植入P24/ PLGA-[ASP-PEG]仿生骨基质材料,B组植入PLGA-[ASP-PEG]材料;C组,植入单纯的明胶海绵。5孔钢板螺钉内固定。X线观察,组织学观察、修复组织ALP测定以及生物力学测试,比较各组材料修复骨缺损的能力。结果X线显示及评价:A组8周骨痂与宿主骨界限模糊,骨痂密度不均匀,皮质骨轮廓出现,骨缺损已基本消失,有典型的骨愈合影像;12周骨痂开始塑性,新生骨皮质结构清晰,与断端骨自然连接,髓腔有再通趋势。按照X线骨缺损愈合分级,16周时4级以上为9只（优良率64.28%）。B组12周缺损区有少量骨痂生成,断端吸收变细,髓腔开始闭锁,缺损区依然存在。X线骨缺损愈合分级0级为5只（占62.5%）。C组:12周骨缺损区表现为骨不连影像,髓腔闭锁,钢板有松动迹象。X线骨缺损愈合分级均为0级。组织学观察:A组:8周时成骨细胞活跃,新骨大量增生,相互融合生长,呈编织骨和骨小梁结构,骨小梁钙化形成板层股。12周时编织骨增厚密集,呈典型的板层骨结构,骨细胞趋于成熟,有血管形成和长入,不规则骨髓腔出现。B组:8周纤维组织增生,材料部分吸收。12周植入区两端与宿主骨交界处,新骨增生,可见骨小梁和板层骨。植入区中央材料大部分吸收,可见大量的纤维组织,偶见软骨细胞。C组:12周缺损区被纤维结缔组织填充,骨端增生不活跃,髓腔封闭。生物力学测试:A组最大抗弯曲负荷122.14±12.83N,与同组正常骨参照值相比,修复比率为87.42%。B组最大抗弯曲负荷38.38±8.09N,与同组正常骨参照值相比,修复比率为26.89%。二者具有统计学差异性（P<0.05）。结论体外构建的P24/PLGA-[ASP-PEG]仿生骨基质材料是一种理想的组织工程支架材料,能诱导启动典型的软骨内化骨过程,促进骨缺损的修复。
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